PCR實(shí)驗(yàn)步驟:
典型的PCR由(1)高溫變性模板;(2)引物與模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán),通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng),使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。
其主要步驟是:
將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈;
人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合,兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短;
耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入,以目的基因?yàn)槟0鍙?/span>5’→3’方向延伸,合成DNA的新互補(bǔ)鏈。
具有下列特點(diǎn):
1.即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板,操作簡(jiǎn)單,定量準(zhǔn)確快速。
2. 引物經(jīng)過(guò)優(yōu)化,特異性強(qiáng)。預(yù)期的 PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為 560 bp。
3. PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳。
4. 提供陽(yáng)性對(duì)照,便于分析試驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品名稱 | 烏梢蛇PCR試劑盒 |
規(guī)格 | 50次 |
貨號(hào) | CP101214 |
特點(diǎn)優(yōu)勢(shì):
1. 特異性:所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過(guò)詳盡的生物信息學(xué)分析,經(jīng)過(guò)GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì),確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段,可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌種屬及血清型的特異檢測(cè),特異性均達(dá)到100%。
2. 重現(xiàn)性:該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)菌株的驗(yàn)證,重現(xiàn)性為100%。
3. 靈敏性:該系列產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)菌的高靈敏檢測(cè),當(dāng)樣品中細(xì)菌的濃度達(dá)到103cfu/ml時(shí),可實(shí)現(xiàn)對(duì)其的直接檢測(cè),無(wú)需繁瑣的增菌過(guò)程。
4. 實(shí)用性:檢測(cè)范圍廣,涵蓋了對(duì)人體危害較為嚴(yán)重的17種呼吸道及腸道致病菌,可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測(cè),整個(gè)檢測(cè)過(guò)程為3-4個(gè)小時(shí)。
5. 優(yōu)勢(shì)1:序列資源豐富,除GenBank公布的序列外,公司還進(jìn)行了大量菌株的序列破譯,從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。
6. 優(yōu)勢(shì)2:該系列試劑盒均經(jīng)過(guò)大量的保守性及特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,憑借公司擁有的豐富的菌種資源,每一種檢測(cè)試劑盒均經(jīng)過(guò)了20余種標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的保守性驗(yàn)證及40余種近緣標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的特異性驗(yàn)證,確保在使用過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)任何的假陽(yáng)性及假陰性報(bào)告結(jié)果。
反應(yīng)五要素:
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長(zhǎng)度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn), 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟:
①取凍存已裂解的細(xì)胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混勻后,4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí),先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,使其*溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
梭砂貝母堿(標(biāo)準(zhǔn)品)Hupehenine質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品 小鼠血管生成素樣蛋白7(ANGPTL7)ELISA試劑盒 ,英文名: ANGPTL7 ELISA Kit PDGFsR-α小鼠血小板衍生生長(zhǎng)因子可溶性受體α規(guī)格:48T/96T
特女貞苷(標(biāo)準(zhǔn)品)Specnuezhenide質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品 兔子皮質(zhì)醇(Coisol)ELISA檢測(cè)試劑盒RabbitCoisolELISAKit 96T/48T HumanCholicacid,CAELISAKit人膽酸(CA)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
天麻素(標(biāo)準(zhǔn)品)Gastrodin質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品 犬α-1/2干擾素(IFN-α1/2)試劑盒 Canine Ierferon alpha-1/2 ELISA kit 人前鐵調(diào)素(Pro-Hepcidin)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
殺螟丹標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=3%)Aramite solution質(zhì)量規(guī)格:10μg/ml,u=3% 英文名稱HumanNeuroophin-3,-3ELISAKIT人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(-3)規(guī)格:96T/48T 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2/Flk-1)試劑盒 Mouse Vascular endothelial cell growth factor receptor 2,VEGFR-2/Flk-1 ELISA kit
衣霉素 Tunicamycin質(zhì)量規(guī)格:>98%,進(jìn)分 MouseL-Phenylalanineammonla-lyase,PALELISA試劑盒小鼠L苯氨酸解氨酶(PAL)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T 胰蛋白酶原激活肽(TAP)ELISA試劑盒 ,英文名: TAP ELISA Kit
甲溴東莨菪堿(標(biāo)準(zhǔn)品)Scopolamine methyl bromide質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品 小鼠染色質(zhì)裝配因子1亞基B(CHAF1B)ELISA試劑盒 ,英文名: CHAF1B ELISA Kit MouseAialNaiureticPeptide,ANPELISA試劑盒小鼠心肽(ANP)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
甘氨鵝脫氧膽酸鈉Glycochenodeoxycholic Acid Salt質(zhì)量規(guī)格:>97%,BR 豬胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)ELISA檢測(cè)試劑盒Porcineinsulin-likegrowthfactors-1,IGF-1ELISAKit 96T/48T ELISAKitIL-2sRβ小鼠白介素2可溶性受體β鏈規(guī)格:48T/96T
BGJ398(NVP-BGJ398)BGJ398(NVP-BGJ398)質(zhì)量規(guī)格:>98%,FGFR抑制劑 大鼠周脂素(Plin1/Peri/Plin)試劑盒 Rat Perilipin-1,Plin1/Peri/Plin ELISA kit GoatBeta-Endorphin,β-EPELISAKit山羊β內(nèi)啡肽(β-EP)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
烏梢蛇PCR試劑盒dATP溶液
DNA電泳液分子量標(biāo)準(zhǔn)C
蛋白質(zhì)電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)