| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品包裝 | 產(chǎn)品價(jià)格 |
| C4007-100μl | Lenti-CMV-CD9-EGFP (10^9TU/ml,外泌體示蹤用) | 100μl | 2888.00元 |
| C4007-500μl | Lenti-CMV-CD9-EGFP (10^9TU/ml,外泌體示蹤用) | 100μl×5 | 11588.00元 |
Lenti-CMV-CD9-EGFP（外泌體示蹤用），即Lentivirus expressing CD9-EGFP fusion protein，是碧云天自行研發(fā)的一種可以在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞(包括原代細(xì)胞和干細(xì)胞)中通過CMV啟動子表達(dá)人源CD9-EGFP融合蛋白的重組慢病毒。本產(chǎn)品可用于外泌體的示蹤研究，用于研究外泌體的形成、分泌、靶向和運(yùn)輸機(jī)制。本產(chǎn)品帶有嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因，感染細(xì)胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株。
外泌體(Exosome)是膜包裹的細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直徑約為40-160nm，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，天然存在于血液、尿液、腦脊液，以及體外培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中[1]，幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放外泌體[2]。如圖1所示，細(xì)胞膜內(nèi)吞(Endocytosis)依次形成初級內(nèi)體(Early sorting endosome, ESE)、次級內(nèi)體(Late sorting endosome, LSE)和多囊泡體(Multivesicular body, MVB)，其中多囊泡體包含腔內(nèi)囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs)。多囊泡體與細(xì)胞膜融合形成外泌體，外泌體攜帶多種來自其母體細(xì)胞的成分(包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類和代謝物等)釋放到胞外基質(zhì)中[3]。外泌體可以被附近或遠(yuǎn)距離的細(xì)胞識別和融合，是細(xì)胞間進(jìn)行相互調(diào)控的重要媒介，參與了癌癥、神經(jīng)退行性病變和炎癥性疾病等多種疾病的發(fā)病過程，影響細(xì)胞多方面的功能[4-5]。
圖1. 外泌體的形成原理及其攜帶的母體細(xì)胞成分示意圖。
外泌體標(biāo)志蛋白(Protein biomarkers for exosome)，也稱外泌體蛋白標(biāo)志物(Protein markers for exosome)，可以用于鑒定、觀察、標(biāo)記和純化外泌體。據(jù)外泌體據(jù)庫統(tǒng)計(jì)來自不同生物、細(xì)胞類型和體液的外泌體中已發(fā)現(xiàn)9769種蛋白質(zhì)，ExoCarta列出了100種常見外泌體蛋白標(biāo)志物，其中CD9、CD63、CD81、Alix、Flotillin、Ceramide和Tumor susceptibility gene 101 (TSG101)是常用的外泌體蛋白標(biāo)志物(如圖2所示[3])。CD9在人體中由CD9基因編碼的蛋白質(zhì)抗原，是跨膜四超家族(Transmembrane 4 superfamily)成員之一，為4次跨膜蛋白，大量存在于細(xì)胞外囊泡的表面，也會出現(xiàn)在普通的細(xì)胞膜表面。CD9是常用的外泌體蛋白標(biāo)志物之一，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移，同時(shí)還可以觸發(fā)血小板活化和聚集，被認(rèn)為是血小板活化標(biāo)志物[6]。
圖2. 常見的外泌體蛋白標(biāo)志物示意圖。
Lenti-CMV-CD9-EGFP感染HEK293T細(xì)胞后的表達(dá)效果如圖3所示。
圖3. 碧云天生產(chǎn)的Lenti-CMV-CD9-EGFP (C4007)感染HEK293T細(xì)胞的效果圖。96孔板每孔10,000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后用相應(yīng)的病毒TU數(shù)進(jìn)行感染，病毒感染72小時(shí)后熒光顯微鏡實(shí)拍相同大小視野效果圖。實(shí)際檢測效果會因檢測儀器、實(shí)驗(yàn)條件的不同而存在差異，本圖僅供參考。
慢病毒感染細(xì)胞后會將目的基因隨機(jī)整合到基因組DNA上，因而可以長期穩(wěn)定地表達(dá)目的蛋白，并且?guī)缀蹩梢愿腥舅胁溉閯游锛?xì)胞，在很多不分裂的細(xì)胞中也可以長期穩(wěn)定表達(dá)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)。
本產(chǎn)品表達(dá)嘌呤霉素抗性基因，因此本產(chǎn)品感染培養(yǎng)的細(xì)胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株以用于后續(xù)研究。
碧云天的Lenti-CMV-CD9-EGFP是復(fù)制缺陷型慢病毒。其3' LTR的增強(qiáng)子功能發(fā)生缺失，形成了自失活(Self-inactivating) 3' LTR，并且5' LRT中的U3區(qū)域替換成CMV啟動子，在感染普通的細(xì)胞后不能進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增，從而有效降低了本產(chǎn)品在活體生物中的風(fēng)險(xiǎn)。
碧云天推薦的慢病毒感染不同種類體外培養(yǎng)細(xì)胞的MOI值參見下表。
| Cell line | Tissue | Cancer/cell type | Species | MOI |
| A431 | Epithelial | Carcinoma | Human | 5 |
| A549 | Lung | Carcinoma | Human | 5 |
| Astrocytes | Nervous system | Primary | Human | 1 |
| B16-F10 | Epithelial | Melanoma, metastatic | Mouse | 5 |
| BMM | Bone Marrow | Primary | Human | 8 |
| BxPC-3 | Pancreas, epithelial | Adenocarcinoma | Human | 10 |
| H3255 | Lung | Carcinoma, NSCLC | Human | 10 |
| HCT116 | Colon | Carcinoma | Human | 5 |
| HeLa | Cervix | Carcinoma, epithelioid | Human | 3 |
| HEK293T | Kidney | Tumor | Human | 5 |
| Hepa1-6 | Liver | Carcinoma | Mouse | 3 |
| HMVEC | Endothelial | Endothelial, microvascular | Human | 100 |
| HT-29 | Colon | Adenocarcinoma | Human | 3 |
| HUVEC | Umbilicus | Endothelial cells | Human | 100 |
| Jurkat | Blood | Leukemia, Acute T cell | Human | 10 |
| LLC-1 | Lung | Carcinoma | Mouse | 6 |
| LNCaP | Prostate | Carcinoma | Human | 5 |
| MM200 | Skin | Melanoma | Human | 5 |
| MCF-7 | Breast | Adenocarcinoma | Human | 2 |
| MDA-MB-231 | Breast | Adenocarcinoma | Human | 1 |
| MM-AN | Skin | Melanoma, metastatic | Human | 16 |
| MMC | Breast | Carcinoma | Mouse | 4 |
| MRC-5 | Lung, embryonic | Fibroblasts | Human | 1 |
| NB4 | Blood | Leukemia, acute promyelocytic | Human | 10 |
| PC12 | Adrenal gland | Pheochromocytoma | Rat | 20 |
| SKOV-3 | Ovary | Adenocarcinoma | Human | 15 |
| U-2 OS | Bone | Osteosarcoma | Human | 5 |
實(shí)驗(yàn)室常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺相關(guān)病毒(AAV)和腺病毒(Adenovirus)的主要特征之間的比較和差別參見下表。具體的特定病毒的一些特征和下表相比可能會有一定差異。
| Retrovirus | Lentivirus | AAV | Adenovirus | |
| Genome | ssRNA(+) | ssRNA(+) | ssDNA | dsDNA |
| Coat | Enveloped | Enveloped | Naked | Naked |
| Particle size | 90-100nm | 90-100nm | 20-30nm | 60-90nm |
| Genome size | 7-10kb | 9kb | 5kb | 38-39kb |
| Genome integration | Yes | Yes | No | No |
| Packaging capacity | 2.5-5kb | 2.5-6kb | 2.5-4.5kb | 3-8kb |
| Infection tropism | Dividing cells | Dividing and non-dividing cells | Dividing and non-dividing cells | Dividing and non-dividing cells |
| Relative Transduction Efficiency | ND | 70% | 70% | 100% |
| Expression started | 48-72h | 48-72h | 72-96h | 24-48h |
| Expression duration | > 2 months | > 2 months | > 6 months | 3-4 weeks |
| Expression level | Medium | Medium | Medium | High |
| Immune response | Low | Low | Very low | High |
| In vivo safety | Medium | Medium | High | Low |
| Titer before concentration (IFU/ml) | 106 | 107 | 1011 | 107 |
| Titer after concentration (IFU/ml) | ND | 108 | 0.5-1×1013 | 1010 |
| Able to obtain high MOI | No (≤ 10 copies integrated) | No (≤ 10 copies integrated) | Yes | Yes |
| Biosafety level | BSL-2 | BSL-2 | BSL-1 | BSL-2 |
本產(chǎn)品的滴度不低于10^9TU/ml，適合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或活體動物實(shí)驗(yàn)。TU, transduction unit，即轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。TU通過本產(chǎn)品梯度稀釋后感染HEK293T細(xì)胞后測定獲得，能讓一個(gè)HEK293T細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光的活力單位定義為1TU。MOI (Multiplicity of Infection)是病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量的比值。使用10^9TU/ml的本產(chǎn)品，如果按照5 MOI感染6孔板的細(xì)胞，每孔50萬細(xì)胞計(jì)算，100μl共可以感染40個(gè)孔；如果按照5 MOI感染24孔板的細(xì)胞，每孔10萬細(xì)胞計(jì)算，100μl共可以感染200個(gè)孔。如果MOI值提高，相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會減少；如果MOI值下調(diào)，相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會增加。
包裝清單：| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C4007-100μl | Lenti-CMV-CD9-EGFP (10^9TU/ml,外泌體示蹤用) | 100μl |
| C4007-500μl | Lenti-CMV-CD9-EGFP (10^9TU/ml,外泌體示蹤用) | 100μl×5 |
| － | 說明書 | 1份 |
-80℃保存，一年有效。-20℃保存，1-2個(gè)月內(nèi)有效。4℃保存，一周內(nèi)有效。
注意事項(xiàng)：反復(fù)凍融會降低病毒滴度，如有必要請?jiān)谑盏奖井a(chǎn)品后分裝保存。分裝時(shí)必須在冰浴上進(jìn)行。病毒融解后，如果在一周內(nèi)使用，可以放于4℃，但須注意4℃存放時(shí)間越長，滴度下降越明顯。如果-80℃保存時(shí)間超過一年，可能會導(dǎo)致滴度下降，此時(shí)建議重新測定病毒滴度。
本產(chǎn)品使用前請仔細(xì)閱讀附錄1《慢病毒使用安全規(guī)范》。本產(chǎn)品生物安全等級為Biosafety Level 2 (BSL-2)，在按照常規(guī)的微生物實(shí)驗(yàn)操作要求進(jìn)行操作(Standard microbiological practices)的基礎(chǔ)上，還需要注意限制接觸、生物危害提示、顯著的警示標(biāo)識、并制定相應(yīng)的安全規(guī)范。
病毒操作中應(yīng)注意有效防護(hù)，絕對禁止在生物安全柜內(nèi)有任何皮膚直接暴露的情況。實(shí)驗(yàn)完成后，請及時(shí)清洗雙手。嚴(yán)禁直接接觸病毒，如意外接觸，請及時(shí)用清水沖洗，并適當(dāng)用70%乙醇對皮膚進(jìn)行消毒。
任何接觸過病毒的材料、試劑、樣品，應(yīng)經(jīng)消毒處理，可以采用1%的SDS溶液、或84消毒液(1:20)浸泡30分鐘以上，或121℃高壓滅菌30分鐘。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
Lenti-CMV-CD9-EGFP（外泌體示蹤用）
