【儀表網(wǎng) 儀表研發(fā)】自噬是指通過(guò)形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，包裹部分胞質(zhì)并運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解及回收的過(guò)程，對(duì)抵抗各種應(yīng)激和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。自噬異與老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。自噬體形成的關(guān)鍵步驟包括隔離膜(自噬體前體)的啟始、成核、延伸及閉合。科學(xué)家對(duì)自噬體形成的分子機(jī)制的了解主要來(lái)自對(duì)單細(xì)胞酵母自噬的研究。多細(xì)胞生物自噬體的形成過(guò)程更加復(fù)雜，包括多個(gè)獨(dú)特的步驟以及多細(xì)胞生物特有的自噬蛋白的參與。
 

　　多細(xì)胞生物自噬與酵母自噬的重要區(qū)別之一在于自噬體形成的位置。酵母自噬體在液泡膜上形成，而多細(xì)胞生物自噬體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)形成。鑒定決定自噬體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成的信號(hào)是自噬領(lǐng)域懸而未決的科學(xué)問(wèn)題。
 

　　10月5日，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研究員張宏課題組在《細(xì)胞》(Cell)上，在線發(fā)表了題為Calcium transients on the ER surface trigger liquid-liquid phase separation of FIP200 to specify autophagosome initiation sites的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)自噬誘導(dǎo)條件下引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的鈣瞬變是決定自噬體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成的關(guān)鍵信號(hào)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的鈣瞬變引起參與自噬起始的FIP200復(fù)合物發(fā)生液-液相分離；形成的FIP200凝聚體進(jìn)而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白VAPs和ATLs結(jié)合定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，成為自噬體起始位點(diǎn)。
 

　　研究顯示，鈣離子快速螯合劑BAPTA-AM可以抑制參與自噬起始的FIP200復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成凝聚體，但這一過(guò)程不能被慢速鈣離子螯合劑EGTA-AM阻斷。這提示快速的局部的鈣離子變化而非穩(wěn)態(tài)的鈣離子濃度變化，可能參與自噬起始過(guò)程?？蒲腥藛T構(gòu)建了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜結(jié)構(gòu)域CYB5與快速鈣離子探針GCaMP6f的融合蛋白，將GCaMP6f定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面朝向胞漿側(cè)，以檢測(cè)自噬誘導(dǎo)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面鈣離子濃度的變化。研究利用多模態(tài)超分辨活細(xì)胞成像技術(shù)(Multi-SIM)發(fā)現(xiàn)，在饑餓或Torin1處理等自噬誘導(dǎo)條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面發(fā)生鈣瞬變/鈣振蕩，而這些鈣信號(hào)能被BAPTA-AM阻斷卻不能被EGTA-AM阻斷。
 

　　研究發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面鈣瞬變/鈣振蕩會(huì)阻礙自噬體形成。鈣離子通道釋放抑制劑以及鈣通道蛋白敲低的細(xì)胞中，自噬起始FIP200復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成凝聚體被顯著抑制，這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面鈣瞬變對(duì)自噬體的形成頗為重要。自噬誘導(dǎo)條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的鈣瞬變/鈣振蕩是被精細(xì)調(diào)控的。在鈣離子通道激活劑處理下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的鈣瞬變/鈣振蕩的幅值、頻率和持續(xù)時(shí)間顯著增加。FIP200凝聚體以及WIPI2等標(biāo)記的早期自噬結(jié)構(gòu)的數(shù)目顯著增加，但自噬流活性卻被抑制，這表明鈣離子通道激活劑的處理抑制有功能性的自噬體結(jié)構(gòu)的形成。電鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些自噬結(jié)構(gòu)顯著變小且不能閉合，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面鈣的持續(xù)增高影響自噬體的延伸及閉合過(guò)程。
 

　　張宏課題組前期利用建立的線蟲遺傳篩選模型鑒定了一系列多細(xì)胞生物特有自噬基因，包括編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的epg-4/EI24。本研究發(fā)現(xiàn)敲除EI24的細(xì)胞，表現(xiàn)出與鈣離子通道激活劑處理類似的現(xiàn)象，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面出現(xiàn)持續(xù)的鈣振蕩，并表現(xiàn)出類似的自噬缺陷。研究通過(guò)化學(xué)試劑處理，或敲低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面鈣通道的活性，可以降低EI24敲除引起的鈣瞬變，并拯救其自噬缺陷的表型。EI24可以與多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道和鈣泵結(jié)合。這提示EI24可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道和鈣泵的活性，進(jìn)而調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面鈣瞬變的幅度、頻率和持續(xù)時(shí)間。
 

　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面鈣瞬變/鈣振蕩是如何決定參與自噬起始的FIP200復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上組裝？研究發(fā)現(xiàn)，自噬誘導(dǎo)條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面發(fā)生的鈣瞬變/鈣振蕩觸發(fā)FIP200復(fù)合物發(fā)生液-液相分離，形成具有高度動(dòng)態(tài)且易于融合的液滴狀FIP200凝聚體。FIP200凝聚體通過(guò)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白VAPs和ATLs結(jié)合，穩(wěn)定定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并沿著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移動(dòng)，與其他FIP200凝聚體融合。在達(dá)到一定大小后，F(xiàn)IP200凝聚體停止融合，成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的自噬體起始位點(diǎn)，招募下游自噬蛋白，啟動(dòng)自噬體的形成。該研究揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面鈣瞬變是決定自噬體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成的關(guān)鍵信號(hào)，促進(jìn)了科學(xué)家對(duì)多細(xì)胞生物自噬分子機(jī)制的理解，并對(duì)探究自噬異常與相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展以及開(kāi)發(fā)新的治療策略有重要意義。
 

　　研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的資助，并獲得生物物理所成像平臺(tái)的技術(shù)支持。
 

　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜鈣瞬變觸發(fā)FIP200復(fù)合物發(fā)生液-液相分離，并形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上自噬起始位點(diǎn)的模式圖