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應(yīng)用案例 | 體式鏡下3D影像的數(shù)碼顯示

閱讀：9發(fā)布時(shí)間：2025-1-13

垂直分辨率的奧妙 —— 小付出，大回報(bào)
快速和易用是數(shù)碼顯微鏡的主要特征之一，利用數(shù)碼顯微鏡，即可輕松構(gòu)建表面模型的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)。在定性評(píng)估中，這些宏微觀結(jié)構(gòu)可以令用戶更好地了解樣本，并對(duì)樣本進(jìn)行更詳盡地記錄。此外，表面的定量分析還將提供有關(guān)表面組分及其磨損情況的重要信息。那么，哪些樣本適用于徠卡數(shù)碼顯微鏡，而所用的檢測(cè)方法又有何限制條件呢？
徠卡數(shù)碼顯微鏡的三維成像技術(shù)基于自動(dòng)變焦原理。使用光學(xué)器件的景深限定值確定樣本的深度信息。樣本相對(duì)于物鏡的垂直位移，確定了焦點(diǎn)信息的同時(shí)，還能夠確定其與光學(xué)器件的間距。針對(duì)每個(gè)垂直位置，將銳聚焦圖像區(qū)域與模糊區(qū)域隔開(kāi)，這兩個(gè)圖像區(qū)域都經(jīng)由軟件處理，以便構(gòu)建表面模型。除了高度信息之外，采用該技術(shù)手段的優(yōu)勢(shì)還包括，記錄樣本的結(jié)構(gòu)。成功構(gòu)建三維表面模型有哪些決定性影響因素，以及這些參數(shù)又是如何影響橫向和垂直分辨率的？
光學(xué)器件
在顯微鏡中，景深往往被視為一種經(jīng)驗(yàn)參數(shù)。實(shí)際上，它是由數(shù)值孔徑、分辨率和放大倍率之間的相關(guān)性確定的。為了得到視覺(jué)印象，現(xiàn)代顯微鏡的調(diào)整選項(xiàng)會(huì)在景深和分辨率（在理論上，這兩個(gè)參數(shù)具有負(fù)相關(guān)性）之間構(gòu)成一種平衡。
在DIN/ISO標(biāo)準(zhǔn)中，樣本一側(cè)的景深被定義為“樣本平面兩側(cè)空間的軸向深度（在樣本平面中，樣本可以移動(dòng)，圖像聚焦的清晰度不會(huì)受損，同時(shí)圖像平面和物鏡的位置保持不變）。”但是，上述標(biāo)準(zhǔn)并未提供任何提示，闡明如何測(cè)量焦點(diǎn)惡化的檢測(cè)界限值。尤其是放大倍率較低時(shí)，景深可以通過(guò)縮小鏡頭光圈（即減小數(shù)值孔徑）而顯著增加。這通常是通過(guò)孔徑光闌或孔徑光闌共軛平面上的光闌來(lái)完成的。然而，數(shù)值孔徑越小時(shí)，橫向分辨率就越低。因此，問(wèn)題是找到分辨率與景深（取決于樣本結(jié)構(gòu)）之間的平衡。
樣本結(jié)構(gòu)
樣本表面結(jié)構(gòu)包含樣本的所有部分的特性，包括表面的色彩和亮度特性。如前所述，自動(dòng)變焦原理建立在有條理的方法基礎(chǔ)上。樣本中清晰和離焦區(qū)域劃分得越明確，表面模型的效果就越好。該方法特別適用于反差度好的結(jié)構(gòu)。在很多顯微鏡應(yīng)用領(lǐng)域，照明都占據(jù)重要地位，常常是決定成敗的關(guān)鍵所在。如果選擇的照明方式適當(dāng)，即使樣本的結(jié)構(gòu)非常少，亦可對(duì)其進(jìn)行記錄。例如，可以選擇傾斜入射光照明方式，令隱藏的微小結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。
垂直方向上的機(jī)械分辨
在這個(gè)等式中，第三個(gè)影響因素是垂直方向上的機(jī)械分辨率，該術(shù)語(yǔ)表示調(diào)焦驅(qū)動(dòng)器（通常為電動(dòng)） z 軸上的最小可能步距。為了充分發(fā)揮光學(xué)器件的性能，最小可能步距必須小于當(dāng)前所用景深，否則，圖像數(shù)據(jù)就會(huì)丟失。例如，電動(dòng)調(diào)焦驅(qū)動(dòng)器分辨率為 10μm，則適當(dāng)景深為 15μm。
Leica DVM 系統(tǒng)的橫向和垂直分辨率取決于各種不同的影響因素，例如，表面結(jié)構(gòu)或照明器，因此，必須根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域予以確定。利用插值法獲取一半應(yīng)用景深的垂直分辨率。由所用放大倍率的數(shù)值孔徑來(lái)確定橫向分辨率。
景深 —— Berek 公式
在視感景深這個(gè)問(wèn)題上，Max Berek 是發(fā)表觀點(diǎn)的作者，早在 1927 年他就發(fā)表了經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)得來(lái)的結(jié)果。Berek 公式給出了視覺(jué)景深的實(shí)際值，因而沿用至今。Berek 公式的簡(jiǎn)化形式如下：

TVIS：視感景深
n：樣本位于其上的介質(zhì)的折射率。如果樣本被移開(kāi)，則在公式中輸入介質(zhì)的折射率，該介質(zhì)形成變化的工作距離。
λ：所用光的波長(zhǎng)，對(duì)白光來(lái)說(shuō)，λ = 0.55μm
NA：樣本一側(cè)的數(shù)值孔徑
MTOT VIS：顯微鏡的視覺(jué)總放大倍率
如果以上方程中，視覺(jué)總放大倍率為有效放大倍率所取代（MTOTVIS = 500-1000 x NA），則可以看出，景深的個(gè)近似值與數(shù)值孔徑的平方成反比。

照明
選擇適當(dāng)?shù)恼彰鞣绞綄?duì)于實(shí)現(xiàn)成功檢測(cè)至關(guān)重要。徠卡顯微系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)，令您可以為所選光學(xué)器件搭配照明方式，滿足特定應(yīng)用領(lǐng)域的需求。您可以選擇如下照明方式：
可變傾斜入射光照明

該方法可以改變照明方向：垂直-橫向。這種照明方式尤其適用于觀察劃痕或小的凹槽。