介紹

細(xì)胞遷移是胚胎早期發(fā)育和免疫細(xì)胞反應(yīng)等生物學(xué)現(xiàn)象的重要過(guò)程。在炎癥發(fā)生過(guò)程中，T細(xì)胞通過(guò)血管系統(tǒng)向炎癥部位募集是一個(gè)重要的階段。這些T細(xì)胞被不同的細(xì)胞因子招募，如促炎細(xì)胞因子(TNFα， IFN-γ)和趨化因子。在被募集和粘附到內(nèi)皮細(xì)胞后，T細(xì)胞需要通過(guò)一個(gè)稱為穿內(nèi)皮遷移(TEM)的過(guò)程跨越血管壁遷移到炎癥組織。此過(guò)程需要活體組織復(fù)雜的3D環(huán)境對(duì)其成功導(dǎo)航，并通過(guò)重塑胞外基質(zhì)（ECM）或改變細(xì)胞形狀來(lái)擠壓致密結(jié)構(gòu)來(lái)完成。
在本研究中，我們利用MIMETAS ' OrganoPlate®3-Lane 40開(kāi)發(fā)了一種體外實(shí)驗(yàn)，以研究灌注條件下與血管結(jié)構(gòu)相結(jié)合的T細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。將人原代T細(xì)胞置于血管腔中，研究在各種因素存在與否的情況下，隨后外滲和遷移到鄰近的ECM的情況。我們用高內(nèi)涵進(jìn)行成像來(lái)觀察細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的遷移情況。這里，我們介紹了成像和圖像分析方法用于量化在不同濃度的促炎細(xì)胞因子作用下進(jìn)行跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)量。

優(yōu)勢(shì)

• 創(chuàng)建易于規(guī)?；?、與高內(nèi)涵兼容的復(fù)雜的細(xì)胞遷移分析

• 進(jìn)行免疫細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的定量評(píng)估，大量得到分析數(shù)據(jù)如細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞遷移距離

材料
• OrganoPlate platform(MIMETAS) 
• Endothelial cell source
• CD3+ T cells
• AIM V media (Invitrogen, 12055091))
• Collagen I 5 mg/mL (AMSbio Cultrex 3D collagen I rat tail, 5 mg/mL, #3447-020-01)
• 1M HEPES (Life Technologies 15630-122)
• 37g/L NaHCO3 (Sigma S5761-500G)
• PBS (Sigma)
• CellTracker Orange CMRA (Invitrogen, C34551)
• CD3/CD28 Human T-activators DynaBeads(Gibco, 11161D)
• TNFα (R&D systems, 210-TA-020)
• Chemokine trigger
• Image Xpress Micro Confocal(Molecular Devices) 
• MetaXpress Software，version 6.6(Molecular Devices) 
方法

模型

為了評(píng)估灌注條件下與血管結(jié)構(gòu)相結(jié)合的T細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，我們?cè)贠rganoPlate 3通道中培養(yǎng)了一根內(nèi)皮血管。在頂部灌注通道中，內(nèi)皮細(xì)胞以10,000個(gè)細(xì)胞/芯片的密度接種在I型膠原細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)上。附著后在灌注條件下保持培養(yǎng)，在灌注通道內(nèi)生成3D微血管。微血管的炎癥狀態(tài)通過(guò)以劑量依賴性方式添加促炎細(xì)胞因子TNFα來(lái)模擬，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞粘附，參與內(nèi)皮細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。在這個(gè)模型中，通過(guò)在3通道有機(jī)板的底部通道中加入趨化因子，得到一個(gè)趨化因子梯度 。CD3+T細(xì)胞使用CD3/CD28人T細(xì)胞激活劑Dynabeads刺激或未刺激48小時(shí)后，標(biāo)記細(xì)胞，可以實(shí)時(shí)跟蹤T細(xì)胞從內(nèi)皮血管外滲到鄰近的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)程。

Figure1. 
T細(xì)胞灌注內(nèi)皮芯片模型的建立。A)示意圖顯示了OrganoPlate®3-Lane 40的40個(gè)微流控芯片之一，包括三個(gè)通道:兩個(gè)介質(zhì)灌注通道和中間的凝膠通道，每個(gè)通道由Phaseguides™分隔。這些通道連接在芯片的中心，被觀察窗口(OW)覆蓋。B)建立免疫細(xì)胞灌注內(nèi)皮芯片模型的細(xì)胞種植方案示意圖。 

 

Figure 2. 圖像采集與分析工作流程。A) ImageXpress高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)(Molecular Devices)。B) MetaXpress自定義模塊編輯器用戶界面。圖像處理步驟顯示在頁(yè)面左邊，當(dāng)前步驟的圖像和結(jié)果的預(yù)覽顯示在右邊，完整的工作流顯示在底部的縮略圖中。 

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
培養(yǎng)CD3+ T細(xì)胞，部分組使用人T細(xì)胞激活劑Dynabeads刺激48小時(shí)。 
成像和分析
使用ImageXpress®Micro共聚焦系統(tǒng)(Molecular Devices)固定時(shí)間間隔拍攝T細(xì)胞外滲和組織的圖像。采用10倍空氣物鏡(0.45NA)和60μm共聚焦轉(zhuǎn)盤(pán)以0.69x0.69x3µm/pixel (XYZ)的分辨率獲取Z軸的熒光圖像。然后圖像沿z軸做了投影，創(chuàng)建了圖片的最大熒光強(qiáng)度投影(MIPs)。 
然后對(duì)所有圖像使用MetaXpress軟件(Version 6.6, Molecular Devices)定制模塊編輯器(CME)自定義分析方法進(jìn)行分析(圖3)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，CME包含細(xì)胞核計(jì)數(shù)應(yīng)用模塊，在該模塊中，T細(xì)胞根據(jù)大小和與背景的熒光差值被識(shí)別。一系列分析步驟被用來(lái)識(shí)別遷移至ECM通道的細(xì)胞群(圖2)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都對(duì)ECM通道的位置進(jìn)行精準(zhǔn)識(shí)別，以校正不同板之間和板加載時(shí)的位移變化。

結(jié)果

無(wú)論CD3+ T細(xì)胞受刺激與否，均能觀察到細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移(TEM)。兩類細(xì)胞均能觀察到時(shí)間依賴性效應(yīng)，盡管在未受刺激的條件下有更明顯的趨勢(shì)(圖4B和4C)。在受刺激的條件下，在24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)幾乎沒(méi)有觀察到TEM的增加，而在未受刺激的條件下，在24小時(shí)和48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)觀察到受TNFα劑量依賴性的細(xì)胞遷移。在48h時(shí)間點(diǎn)，受刺激的T細(xì)胞發(fā)生跨內(nèi)皮遷移的總數(shù)量明顯大于未受刺激的組。TEM似乎是由非刺激條件下TNFα介導(dǎo)的效應(yīng)和刺激條件下的刺激本身驅(qū)動(dòng)的。

Figure 3.
為高通量圖像分析進(jìn)行自定義模塊編輯器設(shè)置。A)展示了用于識(shí)別T細(xì)胞類群的主要步驟。利用細(xì)胞核計(jì)數(shù)應(yīng)用模塊檢測(cè)圖像中的所有細(xì)胞。識(shí)別結(jié)果通過(guò)位置(質(zhì)心Y)和區(qū)域進(jìn)行過(guò)濾，以更準(zhǔn)確地識(shí)別ECM通道內(nèi)的細(xì)胞。如果需要，可以再加入位置的附加過(guò)濾，根據(jù)細(xì)胞向底部通道的遷移程度進(jìn)行分類。具體的測(cè)量參數(shù)，包括細(xì)胞數(shù)，面積，強(qiáng)度，圓度，也可以通過(guò)測(cè)量參數(shù)選項(xiàng)卡選擇。B)內(nèi)皮血管與CD3+ T細(xì)胞的相差圖像。C)當(dāng)前樣品的Cy5熒光信號(hào)，放大圖。D) CME分析結(jié)果顯示位于ECM通道中CD+ T細(xì)胞的分割覆蓋。藍(lán)綠色標(biāo)記的細(xì)胞位于ECM通道的上半部分，黃色標(biāo)記的細(xì)胞位于ECM通道的下半部分。檢查圖像是否存在可能被分割算法錯(cuò)誤識(shí)別的成像偽影。

Figure 4. 有/無(wú)預(yù)刺激的T細(xì)胞在TNFα作用后的遷移響應(yīng)。A)未受刺激的T細(xì)胞在TNFα作用0小時(shí)、4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)的圖像。觀察到內(nèi)皮細(xì)胞屏障對(duì)面的細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間的推移在增加。B) TNFα作用下，受刺激T細(xì)胞的遷移數(shù)量。C) TNFα作用下，未受刺激T細(xì)胞的遷移數(shù)量。x軸顯示TNFα的作用濃度，以pg/ml為單位。

結(jié)論
總之，我們利用高通量微流控平臺(tái)開(kāi)發(fā)了一種新穎的3D T細(xì)胞外滲和遷移實(shí)驗(yàn)。使用高內(nèi)涵，可以精確提取和評(píng)估不同條件下單個(gè)T細(xì)胞的遷移行為。此遷移實(shí)驗(yàn)捕捉了在灌流下T細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的附著，并由血管壁外滲到下面的組織中。該實(shí)驗(yàn)不受人工膜的影響，并允許3D ECM樣支架和多細(xì)胞的共培養(yǎng)，這是模擬體內(nèi)環(huán)境的關(guān)鍵要求。我們相信，該實(shí)驗(yàn)將提高目前對(duì)T細(xì)胞遷移行為的認(rèn)識(shí)，并可以帶動(dòng)免疫腫瘤學(xué)和自身免疫領(lǐng)域新療法的發(fā)展。