與所有其他基因組模式一樣，CRISPR/Cas 基因療法必須以高效且對患者友好的方式實施。然而，當前的基因遞送方法已出現(xiàn)脫靶效應而且缺乏有效的敲除效率。
本次內容中，來自圖賓根大學醫(yī)學院眼科研究所的 Pietro De Angeli 博士和 the Princess Maxima Center的Maarten 博士討論了 CRISPR/Cas 9 遞送方法的安全性，以及涉及可擴展性和人工智能 (AI) 方法使用的當前趨勢。
01 聚焦安全性特性：CRISPR/Cas 遞送中的 DNA、mRNA 和 RNPs
為了讓 CRISPR/Cas9 基因編輯無縫工作，復合體必須到達細胞核以便能夠定位目標基因。
CRISPR 遞送由質粒 DNA（pDNA）、mRNA 或核糖核蛋白 （RNPs） 介導，前兩者對安全性造成挑戰(zhàn)。通過質粒 DNA 或 mRNA 遞送通常會觸發(fā)先天免疫反應，而 pDNA 并入宿主基因組的風險增加，從而導致長期的不良影響。盡管體外策略可以預測和減輕這些風險，但 CRISPR/Cas9 的特異性問題仍未解決。
CRISPR/Cas9 機制。通過先結合導向 RNA，再結合緊挨在 3-核苷酸 PAM 序列之前的匹配基因組序列來激活 Cas9 酶。然后，Cas9 酶會引起雙鏈斷裂，并通過非同源末端連接 (NHEJ) 或同源定向重組 (HDR) 途徑修復 DNA，從而形成編輯后的基因序列。
為了降低基因編輯的風險，科學家們正在轉向 RNP，RNP 由 Cas9 蛋白與靶向 gRNA 復合而成。這種遞送方法提供了更優(yōu)的特異性和安全性。Maarten 指出迄今為止，復合物在宿主內的時間與 CRISPR/Cas9 基因編輯的精確度之間呈負相關：“mRNA 或 DNA 需要長達一周的時間來進行 Cas9 的轉錄和翻譯，而 RNP 一旦進入細胞核就立即開始工作，并在不到 24 小時內完成任務。Cas9 在細胞核中停留的時間越長，就越有可能找到并積累脫靶位點。這就是為什么安全的基因編輯方法是通過 RNP 提供非常短暫的 Cas9 脈沖。”Pietro 補充說，RNPs 的另一個優(yōu)勢是易于優(yōu)化。“當使用 RNPs 時，更容易調整試劑的濃度，這會影響目標效率。而在基于 DNA 的 CRISPR 遞送中，很難預測和微調轉染效率和 DNA 拷貝數(shù)。”
基于 DNA 或 mRNA 的 CRISPR/Cas9 面臨的另一個挑戰(zhàn)是，它可能會改變宿主的轉錄組和蛋白質組特征。這種轉變主要發(fā)生于宿主為 DNA 和 mRNA 形式的轉錄和翻譯重新組織其能量資源。由此產生的代謝負荷會擾亂宿主代謝，從而改變轉錄組和蛋白酶體。相比之下，作為 RNP 的 CRISPR/Cas9 遞送是一個可以發(fā)揮作用并進行所需基因編輯的復合體，因此不會導致基因組向表達 Cas9 的方向轉變。
02 體外應用：探索 CRISPR 的可擴展性和可行性
CRISPR/Cas9 系統(tǒng)不能作為裸復合體遞送到細胞核中，因此適當?shù)?CRISPR 遞送載體在保護復合體完整性方面起著重要作用。為了解決當前的問題，科學家們分享了來自研究實驗室的開創(chuàng)性工作。
麻省理工學院和哈佛大學的博德研究所副主席 David Liu，他設計了病毒源的脂質納米顆粒（LNPs），可以包裹這種復合物。LNPs 在所有形式的 CRISPR/Cas9 中都展示出了高效的遞送效果，包括預先形成的 RNP。這種機制將復合物的遞送引導到特定相關的器官（Banskota 等人，2022，Cell 185，250–265）。與此同時，Jennifer Doudna 的實驗室通過在蛋白的 C 端和 N 端添加核酸定位信號來增強 Cas9 的位點特異性，體內實驗證實了在小鼠大腦中進行精確的基因編輯（Stahl EC等人，Mol Ther. 2023年8月2日；31(8):2422-2438）。
雖然遞送方法不斷改進，但 CRISPR/Cas9 基因編輯的臨床潛力尚未實現(xiàn)，主要是因為與長時間脫靶編輯相關的病毒遞送仍然是金標準。在非病毒遞送方法中，電穿孔因其與 RNPs 兼容的安全可靠的遞送能力脫穎而出。這種方法在細胞膜上穿孔，允許 RNP 無縫進入細胞質，并防止其內吞或逃逸。
在可擴展性方面，又出現(xiàn)了一系列問題。雖然 Cas9 核酸內切酶可以大批量生產且成本低，而 gRNA 不僅對疾病或治療方法具有特異性，而且對個體也具有特異性。Pietro 認為，gRNA 規(guī)?；牡缆烦錆M了風險。
“目前，我認為問題不在于技術本身，而在于法律框架。大型制藥公司更關注更常見的疾病，因為他們在尋找商業(yè)上可行的機會。屬于這一群體的患者更有可能接受基因編輯治療。對于罕見病的治療，學術和非營利研究機構必須努力為患者提供便利。”據(jù) Maarten 說，罕見疾病的監(jiān)管程序必須有所不同 “對于每種疾病，都必須通過大量的體外數(shù)據(jù)來證明復合物的安全性。對于全球患者數(shù)量有限的罕見疾病，生成這樣全面的報告是不可能的。“目前，Jennifer Doudna 和其他 CRISPR 專家發(fā)起的倡議正在與 FDA 協(xié)商，以放寬對罕見疾病的臨床前數(shù)據(jù)要求和 IND 備案。”該提案涉及使用體外基因編輯來生成編輯后的細胞，然后重新注入患者體內，從而使基因組編輯被視為一種試劑而非藥物。”
03 增強 CRISPR 精準醫(yī)療：CRISPR/Cas 與 AI 及 ML 的協(xié)同作用
機器學習（ML）和人工智能（AI）工具——類似于它們在其他許多領域中發(fā)揮的作用一樣——被認為是基因編輯和基因驅動藥物發(fā)現(xiàn)領域的變革者。就 CRISPR/-Cas9 而言，它們可用于組裝位點特異性和脫靶編輯的大型數(shù)據(jù)集，并將這些數(shù)據(jù)集與不同的堿基編輯器或 3D RNP 結構關聯(lián)。機器學習算法可以針對特定基因給出所需的 gRNA 序列，并且實現(xiàn)特異性水平所需的蛋白質層面上的所有修飾。因此，科學家現(xiàn)在可以設計最安全、最有效的 gRNA。
AI 工具還被用于預測進化程度更高的 CRISPR/Cas9 變異體的療效。為了改進引物編輯，研究人員開發(fā)了 nCas9 (融合為逆轉錄酶的 Cas9 nickase) 以簡化各種基因組編輯類型，如點突變、插入和缺失。雖然這一新型系統(tǒng)在理論上能提供更好的初始編輯效率，但其設計和安全性必須得到全面評估，這正是 AI 工具預測能力發(fā)揮作用的地方。Maarten 再次強調了 AI 在基于基因的藥物發(fā)現(xiàn)中的價值：“它幫助我們掃描數(shù)百種 Cas9-gRNA 組合，以檢測出表現(xiàn)優(yōu)秀的前 10 種組合。”
04 CRISPR 的未來：改變治療方法
傳統(tǒng)的基因組測序不足以闡明疾病的遺傳背景。雖然研究人員可以從一名患者中分離細胞，并將這些基因組與健康的基因組進行比較，但這種比較并不一定能涵蓋導致疾病表型的數(shù)千個點突變。CRISPR/Cas9 基因編輯技術有助于克服這些障礙，并極大地受益于詳細的疾病建模和針對特定突變的個性化醫(yī)療。對 Pietro 來說，治療只是問題的一方面，“我們不僅可以將 CRISPR/Cas9 用作治療工具，還可以將其用作疾病研究的手段。3D 細胞模型，如誘導多能干細胞（iPSC）衍生的類器官，這對于模擬復雜的人類生物學極為寶貴。因此，通過在 iPSC 基因組中引入與疾病相關的突變，我們可以生成能夠分化為疾病表型的細胞培養(yǎng)物。” CRISPR/Cas9 的這一方面值得關注，因為疾病的遺傳背景對開發(fā)強有力的治療工具至關重要。
當然，3D 細胞建模的作用也不可高估。通過 3D 細胞培養(yǎng)技術和 CRISPR/Cas9，研究人員可以生成等基因細胞模型，該模型僅包含從少數(shù)患者提取的細胞的整個基因組景觀。
結論 — CRISPR 研究與應用的未來
CRISPR/Cas9 開啟的治療機會是廣闊的，特別是在體外編輯點突變和基因修復方面以及在未來的體內修復方面。這可以增加攜帶既往難以靶向突變的罕見疾病患者的治療機會。
值得注意的是，CRISPR 并不是一個萬能的解決方案。特別是當談到癌癥時，它并不能否定化療方法的價值。相反，它可以通過深入探究疾病的基因組根源來產生協(xié)同效應，而藥物復合物則在化學酶水平上抑制與疾病相關的機制。將 CRISPR 與 FDA 批準的藥物相結合，可以加速其在主流臨床癌癥治療應用中的普及。
Molecular Devices 致力于通過創(chuàng)新的工具和解決方案來優(yōu)化 CRISPR 技術，助力研究人員實現(xiàn)基因修飾的精準與高效。我們的產品覆蓋 CRISPR 工作流程的各環(huán)節(jié)。
參考文獻
Banskota等人，2022，《Cell》185，250–265
Stahl EC等人，Mol Ther. 2023年8月2日；31(8):2422-2438
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