一．相差鏡檢法(Phasecontrast)
在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過程中,相差鏡檢術(shù)的發(fā)明成功,是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就.我們知道,人眼只能區(qū)分光波的波長(顏色)和振幅(亮度),對(duì)于無色通明的生物標(biāo)本,當(dāng)光線通過時(shí),波長和振幅變化不大,在明場(chǎng)觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本.
相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象,將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?即使是無色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見.這大大便利了活體細(xì)胞的觀察,因此相差鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡.
相差顯微鏡的基本原理是,把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度,使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見.光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射,偏離了原來的光路,同時(shí)被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強(qiáng),振幅增大或減下,提高反差.在構(gòu)造上,相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處:
1.環(huán)形光闌(annulardiaphragm)位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上.
2.相位板(annularphaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ.
二．暗視野觀察(Darkfield)
暗視野實(shí)際是暗場(chǎng)照明發(fā).它的特點(diǎn)和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線.因此,視場(chǎng)成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象.
暗視野的原理是根據(jù)光學(xué)上的丁道爾現(xiàn)象,微塵在強(qiáng)光直射通過的情況下,人眼不能觀察,這是因?yàn)閺?qiáng)光繞射造成的.若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見.
m..m暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡.它的特點(diǎn)是不讓光束由下至上的通過被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進(jìn)入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象.暗視野觀察的分辨率遠(yuǎn)高于明視野觀察,達(dá)0.02—0.004。
三．明視野觀察(Brightfield)
明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式,廣泛應(yīng)用于病理、檢驗(yàn),用于觀察被染色的切片,所有顯微鏡均能完成此功能.
四.偏光顯微鏡(Polarizingmicroscope)
偏光顯微鏡的特點(diǎn)
偏光顯微鏡是鑒定物質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)光學(xué)性質(zhì)的一種顯微鏡.凡具有雙折射的物質(zhì),在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚,當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色發(fā)來進(jìn)行觀察,但有些則不可能,而必須利用偏光顯微鏡.
偏光顯微鏡的特點(diǎn),就是將普通改變?yōu)槠膺M(jìn)行鏡檢的方法,以鑒別某一物質(zhì)是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性).
雙折射性是晶體的基本特性.因此,偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物,化學(xué)等領(lǐng)域.在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用.
五．微分干涉稱鏡檢術(shù)(DifferentialinterferencecontrastDIC)
微分干涉鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60年代,它不僅能觀察無色透明的物體,而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感,并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達(dá)到的某些優(yōu)點(diǎn),觀察效果更為逼真.
原理;
微分干涉稱鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束.分裂出來的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等,光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過被檢物體,在相位上略有差別.由于兩光束的裂距極小,而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象,使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺.
DIC顯微鏡的物理原理不同于相差顯微鏡,技術(shù)設(shè)計(jì)要復(fù)雜得多.DIC利用的是偏振光,有四個(gè)特殊的光學(xué)組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer).偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面,使光線發(fā)生線性偏振.在聚光器中則安裝了偌瑪斯斯棱鏡,即DIC棱鏡,此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y),二者成一小夾角.聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向.最初兩束光相位一致,在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后,由于標(biāo)本的厚度和折射率不同,引起了兩束光發(fā)生了光程差.在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)偌瑪斯斯棱鏡,即DIC滑行器,它把兩束光波合并成一束.
六:熒光顯微鏡(FluorescenceMicroscopy)
熒光鏡檢術(shù)是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體,使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長波長的熒光,然后觀察.
優(yōu)點(diǎn):
?。畽z出能力高(放大作用)
?。畬?duì)細(xì)胞的刺激小(可以活體染色)
．能進(jìn)行多重染色
用途:
?。矬w構(gòu)造的觀察——熒光素
?。疅晒獾挠袩o、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別——抗體熒光等
?。l(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析
七.浮雕相襯顯微鏡(RC)
1975年,RobertHoffman博士發(fā)明
2002年,到期,各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術(shù)產(chǎn)品
原理：斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射,光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影,從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異,增加觀察對(duì)比度。
特點(diǎn)：
1.提高未染色標(biāo)本的可見性和對(duì)比度;
2.圖象顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會(huì)產(chǎn)生光暈;
3.可檢測(cè)雙折射物質(zhì)(巖石切片、水晶、骨頭);
4.可檢測(cè)玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細(xì)胞,器官和組織;
5.聚光鏡的工作距離可以設(shè)計(jì)的更長;
6.RC物鏡也可用于明場(chǎng),暗場(chǎng)和熒光觀
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