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210次 ELISA試劑盒實驗開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫,試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時,均需充分混勻,混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量,如樣品濃度過高時,應(yīng)對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1、 加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?100 ,余孔分別加標(biāo)準品或待測樣品100 ,注意不要有氣泡,加樣 時將樣品加于酶標(biāo)板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標(biāo)準品溶液。
2、 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 (臨用前配制),酶標(biāo)板加上覆膜,37 溫育1小時。
3、 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400 /每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
4、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100 ,加上覆膜,37 溫育1小時。
5、 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,方法同步驟3。
6、 每孔加底物溶液90 ,酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色(反應(yīng)時間控制在15-30分鐘,當(dāng)標(biāo)準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔梯度不明顯時,即可終止)。
7、 每孔加終止溶液50 ,終止反應(yīng),此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。
8、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。
ELISA試劑盒注:
1、 試劑準備:所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。
2、 加樣:加樣或加試劑時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間(包括標(biāo)準品及所有樣品)控制在10分鐘內(nèi)。*設(shè)置復(fù)孔進行實驗。
3、 溫育:為防止樣品蒸發(fā),實驗時將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、 洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5、 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請 配制標(biāo)準品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10 ),以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
6、 反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7、 底物:底物請避光保存,在ELISA試劑盒儲存和溫育時避免強光直接照射。
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