蛋白質(zhì)免疫印跡雜交實(shí)驗(yàn)（Western Blotting）是成熟 mRNA 翻譯指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成量分析檢測(cè)手段中zui經(jīng)典和zui廣泛為業(yè)界認(rèn)可的一種,也是論文中zui常見的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式之一。雖然Western Blot實(shí)驗(yàn)原理比較簡(jiǎn)單，但是實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁瑣和實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，導(dǎo)致剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的小伙伴們，實(shí)驗(yàn)做的焦頭爛額。

    那么如何做出一手漂亮的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果呢，請(qǐng)小伙伴們跟隨恒遠(yuǎn)的腳步，了解Western Blot實(shí)驗(yàn)的相關(guān)知識(shí)，let's go！

    Western Blotting實(shí)驗(yàn)原理：
 
    蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot，簡(jiǎn)稱WB。其基本原理是通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。

    Western Blotting實(shí)驗(yàn)步驟：
    1.樣品制備

    2.電泳分離

    3.轉(zhuǎn)膜

    4.封閉

    5.抗體孵育

    6.清洗

    7.檢測(cè)

    樣品制備

    樣本制備是決定蛋白質(zhì)免疫印跡是否成功的關(guān)鍵步驟之一。樣本必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理。膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還需要注意的一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要加入PMSF抑制酶的活性。思科捷為大家提供強(qiáng)、中、弱三種RIPA裂解液，以及適用于各種類型的蛋白酶抑制劑。

    電泳分離

    準(zhǔn)備好樣品后，第二步就是上樣和電泳分離了，上樣之前小伙伴們要做的必要步驟是確定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度確定上樣量。星博士給大家推薦BCA和Bradford兩款蛋白濃度測(cè)定試劑盒，小伙伴們可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求自行選擇。
 
    測(cè)完了蛋白質(zhì)濃度，接下來就是上樣了。首先要制備凝膠，選用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（EC0003），簡(jiǎn)單省時(shí)。然后安裝電泳槽，將膠片安置在電泳槽中，在電泳裝置中加入SDS-PAGE電泳液。思科捷提供10×的電泳液，稀釋后直接使用，方便快捷。

    上樣結(jié)束后，設(shè)置電泳程序一般濃縮膠80V，分離膠120V，電泳時(shí)間一般為1-2小時(shí)，根據(jù)溴酚藍(lán)指示位置選擇停止電泳時(shí)間即可。

    轉(zhuǎn)膜

    針對(duì)特定分子量大小靶蛋白而選擇適當(dāng)轉(zhuǎn)膜條件（轉(zhuǎn)膜時(shí)間，轉(zhuǎn)膜緩沖液和必要低溫環(huán)境）能夠?qū)?SDS-PAGE 膠上蛋白樣品盡可能*轉(zhuǎn)移到印跡膜上，同時(shí)減少蛋白不必要的降解，這對(duì)于終獲得清晰、可信結(jié)果也是需要考慮因素。轉(zhuǎn)膜方式主要包括濕式電印跡法（*轉(zhuǎn)膜方法）、半干式電印跡（可選的替代轉(zhuǎn)膜方法）以及干式電印跡（有限靈敏度的轉(zhuǎn)膜方法）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣和需求，小伙伴們可以自行選擇轉(zhuǎn)膜方式。
 
    膜的選擇
 
    膜的選擇主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來考慮，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因?yàn)榭赡軙?huì)使得蛋白因透過膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白含量不確定，從而影響終結(jié)果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白選擇0.2um的膜，而大于20KDa的蛋白選擇0.45um的膜。

    靈敏度和分辨率：NC膜高，PVDF膜高

    背景：NC膜低，PVDF膜較高

    結(jié)合能力：NC膜80-110ug/cm2，PVDF膜125-200ug/cm2

    材料質(zhì)地：NC膜干的NC膜易脆，PVDF膜機(jī)械強(qiáng)度高

    溶劑耐受性：NC膜無，PVDF膜有

    操作程序：NC膜緩沖液潤(rùn)濕，避免氣泡，PVDF膜使用前甲醇潤(rùn)濕

    檢測(cè)方式：NC膜ECL檢測(cè)，PVDF膜ECL檢測(cè)

    價(jià)格：NC膜較便宜，PVDF膜較貴

    轉(zhuǎn)膜方式的選擇
 
    濕轉(zhuǎn)：
 
    通常我們?cè)谧鰸褶D(zhuǎn)的時(shí)候，選擇100V恒壓（高強(qiáng)度，因?yàn)榈蛷?qiáng)度時(shí)間較長(zhǎng)，且效率較低），電流控制在120-350mA之間，分子量在60KD以下的60分鐘即可，分子量在60KD以上的需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間60-150分鐘才能確保率的轉(zhuǎn)膜。所以如果你所研究的兩個(gè)蛋白分子量差異比較大（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考慮將膠從中間分開，兩部分分別采用不同時(shí)間轉(zhuǎn)印，能達(dá)到你理想的效果。電轉(zhuǎn)液一般可以重復(fù)使用3次，之后電流會(huì)過大，不適合再使用。

    濕轉(zhuǎn)優(yōu)點(diǎn)：1.轉(zhuǎn)膜條件靈活容易進(jìn)行調(diào)整

              2.多種Buffer可用于優(yōu)化轉(zhuǎn)印

              3.可以延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間

              4.可用于定量Western Blot

    濕轉(zhuǎn)缺點(diǎn)：1.Buffer加熱可能干擾轉(zhuǎn)印

              2.在轉(zhuǎn)印的時(shí)候需要制冷裝置

              3.需要大量的轉(zhuǎn)膜緩沖液

    半干轉(zhuǎn)：
 
    對(duì)于半干轉(zhuǎn)來說，也需要進(jìn)行堆疊組裝（濾紙，膠，膜需要放在轉(zhuǎn)印buffer中進(jìn)行預(yù)平衡）放在裝置電極板的底部，蓋上上極板，高強(qiáng)的電流通過三明治結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)印速度較快，一般小于1h。

    半干轉(zhuǎn)優(yōu)點(diǎn)：1.轉(zhuǎn)膜速度快

                2.用不連續(xù)的Buffer系統(tǒng)優(yōu)化轉(zhuǎn)印的蛋白

                3.轉(zhuǎn)膜緩沖液用量少

                4.容易安裝

                5.對(duì)于同一蛋白的多張膜的分析比較有益

    半干轉(zhuǎn)缺點(diǎn)：1.低分子量蛋白容易轉(zhuǎn)過

                2.對(duì)于分子量＞120KDa的蛋白，轉(zhuǎn)印較困難

                3.轉(zhuǎn)膜過程容易干膠

                4.對(duì)于定量的Western實(shí)驗(yàn)不推薦使用

    需要注意的是：低溫對(duì)于膜的轉(zhuǎn)印是至關(guān)重要的，尤其是在轉(zhuǎn)印時(shí)間較長(zhǎng)而無人監(jiān)管的情況下。針對(duì)剛建的實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)或者一些新蛋白的研究，經(jīng)過轉(zhuǎn)印的膠和膜都要通過染色確定轉(zhuǎn)膜效率（膠用考馬斯亮藍(lán)加熱染色，膜用麗春紅染色，均只需幾分鐘，并不耽誤太多時(shí)間），不然后面的實(shí)驗(yàn)既費(fèi)時(shí)也費(fèi)抗體。

    封閉
 
    在做Western blot實(shí)驗(yàn)中，因固相載體(如NC膜，PVDF膜)表面有很多孔，通過電轉(zhuǎn)，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到膜上，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面。蛋白塞進(jìn)了表面孔里面，但是蛋白并不是連續(xù)的，而有很多空隙，抗體也是蛋白，也會(huì)被吸附在空的洞里，這樣就會(huì)有很多非特異性的信號(hào)。
 
    因?yàn)橛?ldquo;填補(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異性結(jié)合，所以有“封閉”的說法。星博士在此介紹常見封閉液的一些特點(diǎn)，有助于大家選擇：
 
    常見的封閉液——BSA
 
    BSA是常用的封閉液，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的，BSA有很強(qiáng)的免疫原性，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多針對(duì)BSA的抗體，為避免交叉反應(yīng)，不能用BSA，脫脂奶粉封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉液。
 
    常見的封閉液——脫脂奶粉
 
    脫脂奶粉大的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜，但由于成分相對(duì)復(fù)雜，所以適用范圍要狹窄一些。針對(duì)磷酸化蛋白的檢測(cè)不能用脫脂奶粉，脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，使用會(huì)造成高背景磷酸化抗體也許會(huì)導(dǎo)致背景增加，此外，因?yàn)樽陨砗猩锼?，不能用于生物素?biāo)記的抗體系統(tǒng)。
 
    封閉體系并不是一成不變的，不同的封閉體系往往會(huì)得到不一樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由此可見，做Western Blot實(shí)驗(yàn)中，封閉液的選擇也是需要謹(jǐn)慎的。

    抗體孵育
 
    一抗一般按照說明書進(jìn)行稀釋后，室溫孵育1-2h，或者4℃過夜。為了讓抗體充分與蛋白結(jié)合，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室一般會(huì)選擇4℃過夜。一抗孵育結(jié)束后TBST洗滌三次，用稀釋后的二抗，室溫孵育1-3小時(shí)，TBST洗滌三次。
 
    抗體是決定Western Blot實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素，選擇具有一定文獻(xiàn)引用數(shù)的品牌不僅更容易得到清晰可信的結(jié)果同時(shí)更能夠得到同行認(rèn)可，針對(duì)一些表達(dá)峰度高且穩(wěn)定的蛋白可以選擇國產(chǎn)化抗體，既能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性又可降低實(shí)驗(yàn)成本，抗體的保存往往也是大家容易忽略的一個(gè)環(huán)節(jié)，而因抗體保存不當(dāng)造成實(shí)驗(yàn)失敗的例子比比皆是。
 
    保存溫度和條件（僅供參考）
 
    對(duì)于很多抗體而言，分裝成小等份并凍存于-20℃或-80℃是*保存條件。分裝成小等份可zui大程度減少由凍融造成的抗體效價(jià)降低，以及從單個(gè)試劑瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需凍融一次，如有剩余，可將剩余物保存于4℃，建議一周內(nèi)用完。在收到抗體時(shí)，在10000×g下離心20秒以沉積截留于試劑瓶螺紋的溶液，并以小等份轉(zhuǎn)移至低蛋白結(jié)合微量離心管中。小等份的量取決于實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)中通常采用的量。小等份應(yīng)不小于10μl；等份越小，儲(chǔ)液濃度因抗體蒸發(fā)及吸附于保存瓶表面而受到的影響越大。
 
    在大多數(shù)情況下，收到抗體時(shí)在4℃下保存一至兩周，然后再冷凍進(jìn)行長(zhǎng)期保存是可以接受的，但也許腹水液是例外，它可能包含蛋白酶，因而應(yīng)該盡快凍存。不同品牌的抗體保存方式往往不同，具體保存方式需參考產(chǎn)品說明書。
 
    檢測(cè)
 
    抗體孵育完，就到了Western Blot實(shí)驗(yàn)的后一步——檢測(cè)了。
 
    目前常用的檢測(cè)方法是ECL化學(xué)發(fā)光法，主要針對(duì)HRP標(biāo)記的二抗。思科捷為大家提供極超敏和超敏兩種ECL發(fā)光液供大家選擇。一款合適的發(fā)光液能使你的Western Blot圖片更加美觀。

    Western Blot的基礎(chǔ)部分就先講到這里，歡迎小伙伴們?cè)谠u(píng)論區(qū)留言，針對(duì)Western Blot實(shí)驗(yàn)的問題，恒遠(yuǎn)將一一為大家解答。