酶聯免疫吸附測定腫瘤壞死因子試劑盒操作中標本的收集

    用于ELISA測定的臨床標本zui為常用的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前使用血清（漿）標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。

    對用于激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響。如可的松在早晨4：00—6：00之間，會有一峰值出現；生長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內采取數份血樣本，以其中間值為測定值。

    又如當從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療藥物的檢測，應根據藥代動力學選擇服藥后的zui適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響。

ELISA試劑盒操作步驟：

方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法

　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

　　3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

　　5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

方法二　用于檢測未知抗體的間接法

　　1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜；

　　2.次日洗滌3次；

　　3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌；

　　4.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml；

　　5.37℃孵育30-60分鐘，洗滌；

　　6.’zui后一遍用DDW洗滌。

　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

試劑

　?。?font face="Times New Roman">1）　包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:

　　Na2CO3 1.59克

　　NaHCO3　2.93克

　　加蒸餾水至1000ml

　　（2）　洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15M

　　KH2PO4 0.2克

　　Na2HPO4·12H2O　2.9克

　　NaCl　8.0克

　　KCl　0.2克

　　Tween-20　0.05%　0.5ml

　　加蒸餾水至1000ml

　?。?font face="Times New Roman">3）　稀釋液：

　　牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

　　加洗滌緩沖液至100ml

　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10%使用。

　?。?font face="Times New Roman">4）　終止液（2M　H2SO4）：

　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98%）21.7ml。

　?。?font face="Times New Roman">5）　底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:

　　0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml

　　0.1M檸檬酸（19.2克/L）　24.3ml

　　加蒸餾水50ml。

　?。?font face="Times New Roman">6）　TMB（四甲基聯苯胺）使用液:

　　TMB（10mg/5ml無水乙醇）0.5ml

　　底物緩沖液（PH5.5）　10ml

　　0.75%H2O2　32μl

　?。?font face="Times New Roman">7）　ABTS使用液:

　　ABTS　0.5mg

　　底物緩沖液（PH5.5）　1ml

　　3%H2O2　2μl

　?。?font face="Times New Roman">8）　抗原、抗體和酶標記抗體。

（9）　正常人血清和陽性對照血清。

器材

　?。?font face="Times New Roman">1）　聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

　　（2）　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

　?。?font face="Times New Roman">3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

實驗條件的選擇

　　在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

　?。?font face="Times New Roman">1）　固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

　?。?font face="Times New Roman">2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg/ml。

　　（3）　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。

　　（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

自備材料

　　1． 蒸餾水。

　　2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

　　3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

　　1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

　　2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

　　3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

腫瘤壞死因子試劑盒操作注意事項

　　1． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

　　2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

　　3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

　　4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

　　5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

　　6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

　　7． 底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

　　8． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

　　9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

   Elisa試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。ELISA檢測試劑盒是用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗體ELISA檢測。

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