大鼠elisa試劑盒究腎臟形成的時候發(fā)現(xiàn)，將S1P1基因缺失后，會威脅小鼠的生命，不是腎臟損傷，而是其他部位。“我們調查了影響腎血管系統(tǒng)發(fā)育中的基因的功能，”她回憶道。“心臟是首先發(fā)育的器官，所以我們刪除前體細胞中的這個基因后，心臟就出現(xiàn)了嚴重水腫、出血和低心率等異常。
一組研究人員利用一種短雙鏈寡核苷酸來標記CRISPR-Cas誘導的脫靶斷裂，測序這些標簽所在的基因組區(qū)域，就能夠確定脫靶突變的位置。研究表明，就算某個脫靶突變的出現(xiàn)頻率低至0.1%，GUIDE-seq也能夠檢測得到。由于許多脫靶突變發(fā)生在與目標位點差異很大的地方，因此脫靶DSB的數(shù)量和位置是很難預測的。
研究人員先將基因組DNA從人類細胞中提取出來，然后用多個sgRNA-Cas9組合進行消化，zui后進行全基因組測序。他們用一種新的DNA剪切評分系統(tǒng)，鑒定了Cas9在基因組中的剪切模式，即打靶和脫靶位點的特性。研究表明，轉錄自雙鏈寡核苷酸的sgRNA引起了許多脫靶事件，而轉錄自質粒模板的sgRNA沒有這樣的問題。多重化Digenome-seq可以捕捉到很多被其他方法漏掉的良性脫靶位點。研究人員還在此基礎上給出了減少CRISPR-Cas9脫靶效應的指南。
研究人員在目標切割位點的60 bp內(nèi)鑒定出成簇的IDLV整合位點（CLIS）。當他們尋找WAS和TAT基因以外的CLIS時，在TALEN處理的細胞中未找到脫靶位點，而在CRISPR/Cas9核酸酶中發(fā)現(xiàn)一些。之后他們利用芯片預測和深度測序來確定IDLV分析的靈敏度，發(fā)現(xiàn)它能夠檢測頻率低至1%的脫靶切割。
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