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  近期，中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員劉文課題組在上闡明了硫鏈絲菌素（Thiostrepton，TSR）側(cè)環(huán)形成過(guò)程中關(guān)鍵大環(huán)化反應(yīng)的酶學(xué)機(jī)制，相關(guān)成果已于11月24日在線發(fā)表于期刊《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2016, DOI: 10.1073/pnas.1612607113）。

硫肽抗生素是一類古老的生物活性肽抗生素，該家族成員目前已被發(fā)現(xiàn)超過(guò)一百余種。雖然此類天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)復(fù)類多樣，但是其生物合成途徑卻存在共性，即底物均為一段高度后修飾的由核糖體翻譯而來(lái)的多肽。對(duì)于此類抗生素生物合成途徑的研究，不但有利于使用經(jīng)過(guò)改造后的“微生物工廠”來(lái)生產(chǎn)制備新型的藥物前體，還拓展了人們對(duì)于特殊蛋白質(zhì)/多肽翻譯后修飾反應(yīng)的理解和認(rèn)識(shí)。該家族中的硫鏈絲菌素具有*的雙大環(huán)骨架結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的生物活性（包括抗細(xì)菌、抗支原體、抗癌、抗瘧和免疫抑制等活性），引起了科研人員強(qiáng)烈的興趣。

劉文課題組長(zhǎng)期以來(lái)致力于硫鏈絲菌素的生物合成與分子改造的研究。在前期的工作中，他們基于該分子生物合成途徑的特殊性，設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)了一套基于“前體導(dǎo)向突變生物合成”的TSR分子改造策略。利用該策略，他們成功獲得了多個(gè)活性顯著超出母體化合物的TSR衍生物，并制備了*含有氟元素和氯元素的TSR分子（Org. Chem. Front., 2015, 2, 106-109; Org. Chem. Front., 2016, 3, 496-500）。選用其中的部分衍生物作為化學(xué)探針，他們還發(fā)現(xiàn)了一種*的硫肽抗生素殺滅胞內(nèi)寄生菌的雙重作用機(jī)制（Chem. Biol., 2015, 22, 1002-1007），這為未來(lái)抗感染藥物的研發(fā)給出了新的啟示?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，該課題組系統(tǒng)性地闡釋了硫鏈絲菌素的側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)與其優(yōu)良生物活性的構(gòu)效關(guān)系。

在近的研究過(guò)程中，他們基于同樣的策略使用不同的合成前體對(duì)相同的突變菌株進(jìn)行化學(xué)喂養(yǎng)，卻發(fā)現(xiàn)了與預(yù)期產(chǎn)物不一致的硫肽衍生物。在使用前體7-F-QA喂養(yǎng)突變株△tsrT時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)不完整的氟代TSR衍生物，其中喹萘啶酸（QA）結(jié)構(gòu)單元沒(méi)有發(fā)生相應(yīng)的氧化后修飾。以此種具備二酮結(jié)構(gòu)特征的TSR流產(chǎn)產(chǎn)物（shunt product）作為預(yù)期，他們研究了TSR生物合成途徑與分子骨架氧化后修飾相關(guān)的基因功能，通過(guò)基因敲除/回補(bǔ)、化學(xué)喂養(yǎng)、體外酶學(xué)測(cè)活等手段，終確定了P450蛋白TsrP負(fù)責(zé)了TSR側(cè)環(huán)形成過(guò)程中QA結(jié)構(gòu)單元的環(huán)氧化反應(yīng)（ACS Chem. Biol., 2016, 11, 2673-2678）。但是至此，由于沒(méi)有獲得側(cè)環(huán)關(guān)閉過(guò)程中的關(guān)鍵中間體，關(guān)于硫鏈絲菌素側(cè)環(huán)形成的核心酶學(xué)機(jī)制還無(wú)法得到闡明。

而在本研究中，他們繼續(xù)沿用“前體導(dǎo)向突變生物合成”的策略，通過(guò)優(yōu)化6-F-QA作為前體喂養(yǎng)突變株△tsrT后的發(fā)酵時(shí)間，他們成功分離、鑒定了一個(gè)側(cè)環(huán)尚未關(guān)閉但QA基團(tuán)已經(jīng)發(fā)生環(huán)氧化的關(guān)鍵氟代中間體。正是由于氟原子的引入，降低了催化側(cè)環(huán)形成的關(guān)鍵蛋白的酶活，從而導(dǎo)致了這樣一個(gè)中間體的短暫積累；而繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，該中間體會(huì)被轉(zhuǎn)化為終成熟的6’-fluoro-TSR分子。該中間體的分離和鑒定為TSR側(cè)環(huán)生物合成途徑中的酶學(xué)機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)。該課題組成員通過(guò)生物信息學(xué)分析，鎖定了TSR生物合成基因簇中一個(gè)功能尚未得到歸屬的基因tsrI，其編碼的蛋白TsrI隸屬于α/β水解酶超家族。綜合使用基因敲除/回補(bǔ)、化學(xué)半合成模擬底物制備、體外酶學(xué)測(cè)活、化學(xué)喂養(yǎng)等手段，他們證實(shí)了TsrI是硫鏈絲菌素側(cè)環(huán)生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，該蛋白同時(shí)負(fù)責(zé)了先導(dǎo)肽的切除和TSR側(cè)環(huán)關(guān)閉過(guò)程的大環(huán)化反應(yīng)；另外，通過(guò)序列比對(duì)、同源建模和氨基酸點(diǎn)突變研究，他們還在TsrI中確定了α/β水解酶超家族高度保守的“催化三聯(lián)體”氨基酸殘基（Asp-His-Ser）。雖然目前已有十余種α/β水解酶超家族蛋白的不同活性相繼得到了報(bào)道，但是同時(shí)兼具蛋白內(nèi)切酶活性和催化游離氨基進(jìn)行環(huán)氧開(kāi)環(huán)活性的“雙功能”α/β水解酶在此前的研究中卻從未被發(fā)現(xiàn)。該研究中關(guān)于TsrI功能的闡明，不但解決了長(zhǎng)期以來(lái)困擾人們的雙環(huán)硫肽抗生素側(cè)環(huán)如何關(guān)閉的問(wèn)題，更拓展了人們對(duì)于α/β水解酶這一超家族蛋白生化功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和理解，同時(shí)為基于合成生物學(xué)策略改造雙大環(huán)硫肽類抗生素分子結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。