6f152a3423860649ca2eeb815cf0d543 鼓風(fēng)干燥箱 什么是初均速法? 測定物質(zhì)含量的一種方法
復(fù)方銀黃微型灌腸劑主要由黃芩（Sculavia baicalensic Georgi）和金銀花（Lonicera japonica Thunb）等藥組成，具有清熱、解毒、消炎等功效。其主要成分黃芩甙（baicalin）和綠原酸（chlorogenic acid）均具鄰二酚羥基，久置會(huì)氧化降解〔1〕,溫度可加速這一變化過程。本文以綠原酸和黃芩甙含量為指標(biāo)，根據(jù)初均速法原理〔2〕，對(duì)該制劑進(jìn)行加速破壞實(shí)驗(yàn)，用液相色譜法測定其含量的變化，建立直線回歸方程，從而求出r值及室溫有效期和活化能。 1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 1.1 儀器 LC-8A液相色譜儀（日本島津），SPD-6AV可見紫外檢測器，SCL-8A系統(tǒng)控制器，C-R4A數(shù)據(jù)處理機(jī)，LG15-W型高速離心機(jī)（北京*廠），UV-160A紫外可見分光光度計(jì)（日本島津），電熱鼓風(fēng)干燥箱 （南京實(shí)驗(yàn)儀器廠）。 1.2 材料 復(fù)方銀黃微型灌腸劑（自制，批號(hào)為970201），綠原酸與黃芩甙對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為753-8701與715-8501），甲醇（優(yōu)級(jí)純），水（去離子重蒸水），其他試劑均為分析純。 2 方法與結(jié)果 2.1 液相色譜法測定綠原酸與黃芩甙的含量 2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 綠原酸對(duì)照品溶液的制備:稱取綠原酸對(duì)照品4.3 mg，用20％乙腈溶解并定容至25 mL,即得。 黃芩甙對(duì)照品溶液的制備：稱取黃芩甙對(duì)照品9.9 mg，用50％甲醇溶液溶解并定容至25 mL，即得。 2.1.2 供試品的制備 吸取樣品1 mL于10 mL容量瓶中，加20％乙腈稀釋至刻度，再吸取0.025 mL于10 mL容量瓶中，加20％乙腈 稀釋至刻度，高速離心 （15 000 r/min，15 min）待用。 2.1.3 檢測波長的確定 取綠原酸對(duì)照溶液,以20％乙腈溶液為空白進(jìn)行紫外掃描；取黃芩甙對(duì)照品溶液，以50％甲醇溶液為空白，進(jìn)行紫外掃描，譜圖見圖1。綠原酸的zui大吸收波長λmax為326 nm，黃芩甙的zui大吸收波長λmax為280 nm。 2.1.4 色譜條件 綠原酸的色譜條件：Shim-pack CLC-ODS柱（15 cm×6.0 mm）;柱溫：室溫;檢測波長：326 nm;流動(dòng)相：甲醇－水－冰醋酸（22∶78∶1）;流速：1 mL/min;紙速：2.5 mm/min;靈敏度：0.02AUFS。 黃芩甙的色譜條件：Shim-pack CLC-ODS柱（15 cm×6.0 mm），柱溫：室溫;檢測波長：280 nm;流動(dòng)相：甲醇－水－磷酸－三乙胺（60∶40∶0.2∶2 滴）;流速：1 mL/min;紙速：10 mm/min;靈敏度：0.02 AUFS。 圖1 黃芩甙與綠原酸的紫外吸收譜圖 Fig.1 Baicalinchlorgenic acid UV spectrum ——:黃芩甙Baicalin；……:綠原酸Chlorgenic acid. 圖2 黃芩甙與綠原酸對(duì)照品色譜圖 Fig.2 Baicalinchlorgenic acid collator chromatogram a:綠原酸Baicalin; b:黃芩甙Chlorgenic acid. 圖3 樣品色譜圖 Fig.3 Sample chromatogram a:綠原酸Baicalin;b:黃芩甙Chlorgenic acid. 2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 2.1.5.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取綠原酸對(duì)照品溶液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL于10 mL容量瓶中，加20％乙腈至刻度，高速離心（15 000 r/min，15 min），按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL，色譜圖見圖2，以進(jìn)樣量為x軸，峰面積為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為y＝188 186.046 5x－1 914, r＝0.999 9，表明綠原酸對(duì)照品在0.086 μg～0.43 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。 2.1.5.2 黃芩甙標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取黃芩甙對(duì)照品溶液0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL、0.07 mL、0.09 mL，各用50％甲醇溶液稀釋至1 mL，在上述色譜條件下，各以15 μL進(jìn)樣測定峰面積，色譜圖見圖2；以進(jìn)樣量為x軸，峰面積為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為y＝2 413.075＋2.041 028×105x，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 7。表明黃芩甙對(duì)照品在0.059 μg～0.53 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。 2.2 初均速加速破壞法實(shí)驗(yàn) 2.2.1 方法〔2〕 取復(fù)方銀黃微型灌腸劑4支（每組），置電熱鼓風(fēng)干燥箱 內(nèi)經(jīng)下述不同溫度及時(shí)間進(jìn)行恒溫加速破壞實(shí)驗(yàn)（見表1），到時(shí)間后立即取出用冷水冷卻至室溫，終止反應(yīng)。分別將每組的樣品打碎混勻，用HPLC測其綠原酸與黃芩甙含量。 2.2.2 測定結(jié)果 數(shù)據(jù)處理的數(shù)學(xué)模型為以綠原酸和黃芩甙的初始濃度為Coj,將在不同溫度（Ti）和相對(duì)應(yīng)時(shí)間（ti）時(shí)所測濃度分別轉(zhuǎn)換成殘存率（表1）；色譜圖見圖3。按下式計(jì)算不同溫度下的初速度〔2〕 Voj＝（Coj－Cij）/ti 式中Coi、Cij分別為綠原酸和黃芩甙在室溫下與不同實(shí)驗(yàn)溫度下的濃度；ti是與溫度相對(duì)應(yīng)的恒溫時(shí)間（h）?！瞛＝1（綠原酸）、2（黃芩甙）；i＝1,2,3,…,m〕 以lgvoj對(duì)1/T回歸，得直線回歸方程lgvoj＝a＋b/Ti和直線相關(guān)系數(shù)r,再根據(jù)Arrhinius公式lgvoj＝〔－E/（2.303×RTi）〕＋lgA，式中R為氣體常數(shù)，R＝1.987卡.度-1.克分子-1求出活化能E。 由直線回歸方程求出室溫（298 K）下的lgv298K，由反對(duì)數(shù)求得v298K。 由Voj＝（Coj-Cij）/ti求出室溫貯存期，即計(jì)算T＝298 K時(shí)100％-C％＝10％時(shí)的時(shí)間t，得。 綠原酸數(shù)據(jù)處理結(jié)果：lgvo1＝19.824 237-6902.652 72 1/T ，｜r｜＝0.991 8，E＝31.58 696 KCal/mol，V298K＝4.581 137×10-4h-1，＝2.49年。 黃芩甙數(shù)據(jù)處理結(jié)果：lgvo2＝20.727 948-7129.837 18 1/T ，｜r｜＝0.985 5，E＝32.626 57 KCal/mol，V298K＝6.343 36×10-4h-1，＝1.80年。 表1 加速破壞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) Table 1 Initial-uniform breaking velocity test data 恒溫時(shí)間 Thermostatic time ti （h） 溫度 Temperature Ti （K） 綠原酸含量Ci1 Chlorgenic acid content （%） 黃芩甙含量Ci2 Baicalin content （％） 1 363 93.93 89.08 2 358 94.61 90.96 3 353 95.03 91.87 4 348 95.30 90.53 5 343 96.55 93.35 6 338 97.89 96.32 7 333 99.12 98.26 8 328 99.66 99.28 9 323 99.76 99.75 3 討論 金銀花和黃芩是銀黃微型灌腸劑中的主要藥物，綠原酸是金銀花中比較明確的有效成分之一，黃芩甙是黃芩中比較明確的有效成分之一，因此本文以綠原酸和黃芩甙的含量變化為指標(biāo)。 待測組分與雜質(zhì)在本文色譜條件下達(dá)到良好的分離效果，所得回歸方程滿意。表明，應(yīng)用液相色譜法測定銀黃微型灌腸劑中主要成分綠原酸和黃芩甙的含量變化是可行的。 采用初均速法測定的綠原酸和黃芩甙活化能數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔4〕報(bào)道27.4 Kcal/mol、27.0Kcal/mol相近，表明預(yù)測的有效期可作為控制該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)參考數(shù)據(jù)