現(xiàn)在常用的幾種ELISA試劑盒辦法有：測(cè)定抗體的直接法，測(cè)定抗原的雙抗體夾心法和測(cè)定抗原的競(jìng)爭(zhēng)法等。本實(shí)驗(yàn)選用直接法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)。其主要進(jìn)程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反響板的凹孔內(nèi)，加待測(cè)抗體，保溫后洗刷以除去未的雜蛋白質(zhì)，加酶標(biāo)抗抗體，保溫后洗刷，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿停止酶促反響，用目測(cè)或光電。
①抗原包被：兔抗人IgG ELISA試劑盒作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔參加聚苯乙烯96孔反響板中。4℃放置過(guò)夜。
②洗刷：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗刷液洗3次。
③關(guān)閉：加l00μL/孔關(guān)閉液，室溫放置0.5h.
④洗刷：用洗刷液洗3次。
⑤加待測(cè)樣品(一抗)：將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS 接連稀釋(依照1：2或1：10)，100μL /孔加到 已包被的板上，每個(gè)樣品平行做兩份，PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。加蓋37℃恒溫箱溫育 1~2h。
⑥洗刷：用洗刷液洗3次。
⑦加酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用關(guān)閉液l ：8000稀釋，100μL／孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。
⑧洗刷：用洗刷液洗5次，蒸餾水洗2次。
⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍(lán)色。
⑩ELISA試劑盒停止反響、比色：加50μL/孔停止液。ELISA試劑盒色彩變黃；用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm 處各孔的吸光值，陽(yáng)性反響的zui大稀釋度為待測(cè) 樣品的效價(jià)。
會(huì)員1.png)