猴B皰疹病毒熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒使用方法

一、樣品 DNA 的制備

1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的柱式病毒 DNAout。

二、引物的制備（在樣品制備室進(jìn)行）

2.按引物標(biāo)簽提示在裝引物干粉的管中直接加入適量的超純水（加入量見(jiàn)引物試管上的標(biāo)簽），使得兩條引物的濃度均為 10 μM（10 pmol/μL），然后各取 50 μL混合在一起，標(biāo)注為引物混合物，放冰上待用。

三、稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，

因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成

分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，

  猴B皰疹病毒熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒(染料法)

 Herpesvirus simiae qPCR Kit（Dye based）                                     CAT#:11-180703

只提供可以直接使用的長(zhǎng)為 124bp 的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。3. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

4.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

5.先將本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照用超純水 10 倍梯度稀釋到 10E8 拷貝/μL。放冰上待用。

6.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

7.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

8.換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5 拷貝/ μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

9.換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 4 號(hào)管中，得 10E4 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

三、設(shè)置 PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10.在 PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

成分 樣品 陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照（2-7 管）

2×qPCR Mix 10 μL 10 μL 各 10 μL

引物混合物 2 μL 2 μL 各 2 μL自備 10×ROX (見(jiàn)注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

待測(cè)樣品 DNA 模板 1-5 μL 不加 不加

各 5μL（2 號(hào)樣到陽(yáng)性對(duì)照（2-7 號(hào)） 不加 不加 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3

號(hào)管…）

補(bǔ)水到 20 μL 20 μL 20 μL

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行

優(yōu)化）。

過(guò)程 溫度 時(shí)間

預(yù)變性 95℃ 5 分鐘

PCR 反應(yīng)

（40 個(gè)循環(huán)） 95℃ 15 秒

60℃ 60 秒

12.數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)， 大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光譜在 530 nm。

四、數(shù)據(jù)處理

13.以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品

濃度的 log 和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品 DNA 的濃度。

 產(chǎn)品保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存