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175次海洋微生物菌種操作方法
1、直接法免疫血清的制備
取體重2~3Kg的雄雞1只,免疫前采血8~10mL,測其正??贵w。靜脈注射新城疫弱毒新鮮尿囊液病毒2mL,同時腹腔注射8mL,2~4d后同法再免疫一次。第二次免疫后七天試血,血清凝集價在1︰320以上為合格即可全采血;如果不合格,可在第二次免疫后10d左右,用同法再免疫一次,一般都可獲得價的免疫血清。制備抗病血血清時??乖恳螅g隔日期要短。
2、免疫球蛋白抗血清制備方法
此法用于制備間接法抗抗體。因抗原為可溶性,故多需加佐劑。
(1)淋巴結(jié)注射法
1)選擇體重2~3Kg的健康雄性家兔( 2只以上),編號;
2)在家兔兩后腳掌共注射活卡介苗,50mg(約0.6mL.每只足庶部皮下0.1mL,皮內(nèi)0.2mL)。7~10d后,鼠或國窩處淋巴結(jié)腫大如黃豆或蠶豆大??;
3)用二指固定腫大之淋巴結(jié),兩側(cè)淋巴結(jié)各注射加有*佐劑的抗原o.5mL,共1mL。事先將抗原稀釋為 5~10mg/ml,在免疫前一日加入青、*,使青、*的濃度分別為1000U/mL和1000mg/mL。4℃過夜,次日取出與佐劑混合成乳劑。許多單位用兩個注射器分別吸取佐劑與抗原,中間用細(xì)膠管連接,相互推進(jìn)若干次,達(dá)到乳化目的;
4)10~14d后,于兩側(cè)淋巴結(jié)各注射加有*佐劑的抗原0.25~0.5mL(這一次也可以省略);
5)7d后,于兩側(cè)淋巴結(jié)各注射加有不*佐劑的抗原0.25~0.5mL;
6)試血:第三次免疫后7~10d,耳靜脈取少量血,分離血清,用雙擴(kuò)散法,中間孔加抗原(1mg/mL),周圍孔加不同稀釋度的待檢抗血清,37℃、 24h,觀察結(jié)果,效價在1︰16以上,或者中間孔加抗血清,周圍孔加不同稀釋倍數(shù)的抗原。效價達(dá)4000倍以上即可應(yīng)用;
7)放血:效價合格后即可放血。放血前停食12h。動物仰臥固定,頸部剪毛消毒,切開皮膚lOcm,找到頸動脈,將頸動脈和迷走神經(jīng)剝離。選擇血管中段,用兩*夾?。s 5cm),切開,放血(2500g重家兔可放血lOOmL);
8)分離血清:血液放于大試管、平皿或三角瓶中,凝固后,用鉑耳或無菌滴管沿邊緣剝離,先故37122h,再放4℃過夜,使血清充分析出。離心沉淀,鑒定合格,冰箱保存?zhèn)溆??!?br />海洋微生物菌種小鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)ELISA Kit 英文名: Mouse phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK ELISA Kit
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