骨粘連蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒原理：

此法采用定量夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)。用于SPARC特異性抗體已經(jīng)被預(yù)先涂到微孔板。標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸入井，和任何SPARC現(xiàn)在的被綁定的固定化抗體。*共軛的抗體特異于SPARC除去任何未結(jié)合的物質(zhì)后，加入到孔中?？?蛋白共軛的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的洗滌后，加入到孔中。經(jīng)過(guò)洗滌，以除去任何未結(jié)合的抗*蛋白的酶試劑，底物溶液加入到孔中，顯色成比例的量的初始步驟中的約束的SPARC。彩色顯影被停止并測(cè)量的顏色的強(qiáng)度。

樣品采集和存儲(chǔ)：

血清：使用血清分離管（SST）和全血標(biāo)本在室溫下兩小時(shí)或4℃過(guò)夜℃，然后離心15分鐘，在1000×g下。刪除上清即可檢測(cè)，或分裝和店內(nèi)樣品在-20°C或-80°C。但應(yīng)避免反復(fù)凍融循環(huán)。

等離子：采集血漿中EDTA或肝素作為抗凝血?jiǎng)?。?-8°C在30分鐘內(nèi)收集離心15分鐘，1000×G。即可檢測(cè)，或分裝保存樣本在-20°C或-80°C。但應(yīng)避免反復(fù)凍融循環(huán)。

檢測(cè)程序：

在使用前，將所有試劑和樣品室溫。再次離心樣品解凍后測(cè)定前。據(jù)建議，所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定一式兩份。

1。準(zhǔn)備好所有試劑，工作標(biāo)準(zhǔn)和樣品在前面的章節(jié)中。

2。請(qǐng)確定井?dāng)?shù)的使用，并把任何剩余的井和入袋干燥劑，密封保鮮袋，將未使用的井在4°C的含量布局表

3。每孔加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)和樣品。封面用膠粘帶提供。孵育2小時(shí)，在37℃下一盤(pán)布局記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品檢測(cè)。

4。每孔中取出的液體，不洗。

5。向每孔中加入100μl*抗體（1倍）。蓋上一個(gè)新的膠粘帶。孵育1小時(shí)，在37℃下（*抗體（1X）可能會(huì)出現(xiàn)混濁。預(yù)熱至室溫，輕輕混勻，直到出現(xiàn)均勻解決方案。）

6。吸液的各孔和洗滌，共洗滌三次重復(fù)該過(guò)程兩次。洗凈，每孔填充洗滌緩沖液（200μL）使用噴瓶，多道移液器，歧管器，或autowasher，和，靜置2分鐘，*清除液體的每一步是*的良好的性能。后一次洗滌后，清除任何剩余洗滌緩沖液的吸ordecanting。倒置板和涂抹對(duì)干凈的紙巾。

7。骨粘連蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒向每孔中加入100μl的HRP-抗*蛋白（1×）。量的微量滴定板，用一個(gè)新的粘接劑條。溫育1小時(shí)，在37℃下

8。重復(fù)的愿望/洗滌過(guò)??程中，在步驟6的5倍。

9。將90μlTMB底物添加到每個(gè)孔中。孵育15-30分鐘，在37℃下避光

10。一站式解決方案，每孔加入底物，輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板，以確保充分混合。

11。在5分鐘內(nèi)，設(shè)置至450nm，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度。如果波長(zhǎng)校正，設(shè)置為540nm或570nm處。在540nm或570nm波長(zhǎng)在450nm處的讀數(shù)減去讀數(shù)。該減法校正板的光學(xué)缺陷。在450nm處未經(jīng)修正讀數(shù)直接，可能會(huì)比較高，不太準(zhǔn)確。

骨粘連蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒計(jì)算結(jié)果：

平均每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品的重復(fù)讀數(shù)和平均減去零標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)密度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)減少使用能產(chǎn)生四參數(shù)邏輯（4-PL）的曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件的數(shù)據(jù)。作為一種替代方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)在y-軸的濃度通過(guò)繪制在x-軸為每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度，并繪制一個(gè)通過(guò)在曲線圖上的點(diǎn)的擬合曲線。該數(shù)據(jù)可以通過(guò)繪制的日志的SPARC濃度與OD的日志和可以通過(guò)回歸分析確定佳擬合線線性化。此過(guò)程會(huì)產(chǎn)生足夠的，但不太的適合的數(shù)據(jù)。

如果已稀釋的樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的濃度必須乘以稀釋因子。