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熒光定量PCR是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，并進(jìn)行定量分析。我們通常使用染料法實(shí)現(xiàn)qPCR的實(shí)時(shí)監(jiān)控，那么染料法如何實(shí)現(xiàn)qPCR的實(shí)時(shí)監(jiān)控呢？
染料法就是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，我們常用的染料就是SYBR Green Ⅰ這種染料。這種染料有以下特性：該染料可以非特異地結(jié)合在雙鏈DNA小溝上，而不與單鏈結(jié)合。這里的非特異性是指，只要是雙鏈DNA，它都能結(jié)合上去，不管該雙鏈DNA是否是你期望擴(kuò)增的目標(biāo)基因還是非目標(biāo)基因。這種染料在游離狀態(tài)下幾乎不會(huì)產(chǎn)生熒光，因此儀器也就沒(méi)有反應(yīng)，一旦染料結(jié)合了雙鏈DNA就會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，儀器也就有所反應(yīng)。
那么，具體在擴(kuò)增過(guò)程中。首先，在擴(kuò)增的起始階段，經(jīng)過(guò)熱變形雙鏈DNA發(fā)生解鏈變成單鏈，染料結(jié)合不上去，因此就沒(méi)有熒光信號(hào)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，有雙鏈形成之后，染料就會(huì)結(jié)合在雙鏈形成的小溝上。每形成一個(gè)DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去；染料一結(jié)合，就產(chǎn)生熒光信號(hào)；信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比。那么在PCR的每一個(gè)循環(huán)中這種熒光信號(hào)的積累過(guò)程就能被儀器所實(shí)時(shí)監(jiān)控。
當(dāng)然，由于SYBR Green Ⅰ是非特異性結(jié)合在雙鏈上，所以一旦在PCR擴(kuò)增過(guò)程中有非特異性產(chǎn)物的生成，它也會(huì)產(chǎn)生被儀器所檢測(cè)到的熒光信號(hào)，這種非特異性的信號(hào)與特異性的信號(hào)由于無(wú)法區(qū)分就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。
通常，為了保證我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們?cè)谧鋈玖戏〞r(shí)，通常都會(huì)做熔解曲線，來(lái)幫我們判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可靠。
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