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分離效率和靈敏度較差，保守的分析方法的干擾因素較多。而采用的此法可在5min內(nèi)同時(shí)測(cè)定糖尿病腎病尿樣中的CnCrU和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物.此方法具有快速、需樣量小、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，*可運(yùn)用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測(cè)。

流動(dòng)相含30％（體積比）甲醇和10mmol/LpH6.86磷酸緩沖溶液，摘要】目的建立糖尿病患者尿液中與腎病相關(guān)的非蛋白氮代謝產(chǎn)物（肌酸、肌酐、尿素和尿酸）反相液相色譜分離分析方法.方法：采用AgilentC18200mm4.6mm內(nèi)徑5μm色譜柱。流速0.9mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)200nm柱溫為室溫.結(jié)果：5min內(nèi)可對(duì)患者尿液中上述4種物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，樣品前處理簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性較好（遷移時(shí)間和峰面積的RSD均≤3%線性范圍較寬（肌酸：5~300μmol/L肌酐：10~200μmol/L尿素：1~30mmol/L尿酸：10~1500μmol/L.結(jié)論：此法*適用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞】反相液相色譜；糖尿病腎??；非蛋白氮；尿樣

引言

已引起了人們廣泛關(guān)注.非蛋白氮代謝產(chǎn)物如肌酸（creatinCr肌酐（creatininCn尿素（ureaU和尿酸（uricacidUa即是與DN相關(guān)的幾種物質(zhì).已報(bào)道的有關(guān)這些物質(zhì)的分離分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色譜法［3-6］、毛細(xì)管電泳法［7-9］等.其中比色法和酶法通常只能測(cè)定單一的物質(zhì)，糖尿病并發(fā)腎病（diabeticnephropathiDN糖尿病患者致死的重要原因之一。而且尿液中的一些內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾；液相色譜法則多集中在對(duì)某一種或部分物質(zhì)的測(cè)定上；毛細(xì)管電泳測(cè)定這些標(biāo)志物重現(xiàn)性有待于提高.運(yùn)用反相液相色譜法，對(duì)DN患者尿液中與DN相關(guān)的CrCnU和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物進(jìn)行同時(shí)分離檢測(cè).同時(shí)測(cè)定尿液中的4種物質(zhì)目前還未見(jiàn)報(bào)道.此法具有快速、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，*可運(yùn)用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測(cè).

1資料和方法

水為二次重蒸水1.1資料Agilent1100液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）CrCnUa均購(gòu)自Sigma公司（USASigma甲醇為色譜純?cè)噭ㄌ旖虻诙瘜W(xué)試劑廠）其余試劑均為分析純。.

1.2方法

等度洗脫，1.2.1色譜條件色譜柱為AgilentC18柱（200mm4.6mm內(nèi)徑5μm流動(dòng)相含體積比為30%甲醇和10mmol/LpH6.86磷酸緩沖溶液。流速0.9mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)200nm柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μL.

溶解在40mL重蒸水中，1.2.2規(guī)范溶液的配置和尿樣的處置方法CrCn和U規(guī)范溶液均使用二次重蒸水配置成一定的濃度.Ua溶液的配置方法如下：取30mg磷酸鉀。加熱至60℃，使其*溶解，稱取Ua28mg溶解于熱磷酸鉀溶液中，冷卻至室溫，移入100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，貯存在棕色瓶中保存.尿液樣品的處置方法：取新鮮的尿液用水稀釋1倍后待用.所有溶液每周更換1次，使用前均過(guò)0.45μm水相膜后再用于色譜分析.

2結(jié)果

分別改變緩沖液的pH值、流動(dòng)相（pH6.86中甲醇比例、流動(dòng)相中緩沖液濃度和流動(dòng)相的流速，2.1色譜條件的優(yōu)化固定其它色譜條件不變?？疾炝似鋵?duì)4種物質(zhì)分離的影響。

連續(xù)5次測(cè)定了同一樣品，2.2方法重現(xiàn)性在選定的色譜條件下。對(duì)各物質(zhì)的遷移時(shí)間、峰面積和峰高的重現(xiàn)性進(jìn)行了考察，結(jié)果標(biāo)明，各物質(zhì)的遷移時(shí)間的變化很小（保管時(shí)間的RSD值見(jiàn)表1方法的重現(xiàn)性較好。

按上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，2.3定量規(guī)范曲線、回收率以及zui低檢測(cè)限配置一系列濃度的規(guī)范溶液。將所測(cè)的峰面積對(duì)物質(zhì)的濃度作回歸分析，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9992以信噪比（S/N為3來(lái)測(cè)定檢測(cè)限；

對(duì)規(guī)范溶液和實(shí)際DN尿樣進(jìn)行了分析，2.4樣品分析在選定的色譜條件下。5min內(nèi)4種物質(zhì)即可達(dá)到*分離，分離結(jié)果如圖3所示，實(shí)際DN尿樣中的4種物質(zhì)得到很好的檢出，尿樣里的其他物質(zhì)對(duì)分析無(wú)干擾.采用此法對(duì)某糖尿病患者以及正常人尿樣中的CnCrUUa分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果糖尿病患者尿樣中CnCrUUa含量分別為10.30.6826.72.1μmol/mL正常人尿樣中的CnUUa含量分別為7.736.71.0μmol/mL而Cr未被檢出。

3討論

pH3.5~7.5范圍內(nèi)U和Cr出峰時(shí)間和順序幾乎不隨pH變化而變化；而對(duì)于Cn和Ua來(lái)說(shuō)，3.1pH對(duì)分離的影響其從圖1A中可以看出。其出峰時(shí)間和順序都隨pH變化而變化，當(dāng)pH接近5.5時(shí)，兩者的出峰時(shí)間近乎相同，得不到分離.因此，選擇*pH時(shí)，主要考慮Cn和Ua之間的分離度（Rs以及分析的效率（分析周期短）zui終選擇緩沖能力zui強(qiáng)，分離度較佳（Rs＝4.1pH6.86為優(yōu)化的分離pH

隨著流動(dòng)相中甲醇比例的增加，3.2流動(dòng)相中甲醇比例的選擇從圖1B中可以看出。各標(biāo)志物的出峰時(shí)間隨之減少，分離周期大大縮短，但與此同時(shí)各標(biāo)志物間的分離度也相應(yīng)減少，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇的比例大于40％時(shí)，各物質(zhì)幾乎同時(shí)被洗脫出來(lái)，難以達(dá)到分離.zui終選擇流動(dòng)相中甲醇含量為30％為較佳的比例（此時(shí)分析周期較短，各物質(zhì)間分離度均大于2.0

隨著緩沖液濃度的增加，3.3流動(dòng)相中緩沖液濃度對(duì)分離的影響從圖2A中可以看出。各標(biāo)志物的峰面積隨之減小.而緩沖液濃度為5和10mmol/L時(shí)峰面積比較接近，zui終選擇緩沖能力較強(qiáng)的10mmol/L為*緩沖液濃度。

各物質(zhì)間的分離度是逐漸增加的并且分析周期變短；而當(dāng)流速?gòu)?.9mL/min增加到1.0mL/min后，3.4當(dāng)流速?gòu)?.4mL/min增加到0.9mL/min時(shí)。雖然分析效率有所提高（分離周期從4.8min減少到4.0min但各物質(zhì)間的分離度卻有所減?。ù藭r(shí)的柱壓也過(guò)高：93.1bar.zui終選擇0.9mL/min為*流速。

CnCr和Ua糖尿病患者尿樣中的含量高于正常人（患者尿樣中Cr含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人尿液中Cr含量）而患者尿樣中U含量反而有所降低.這些都說(shuō)明患者腎功能已經(jīng)出現(xiàn)異常，3.5測(cè)定結(jié)果的分析從某糖尿病患者以及正常人尿樣測(cè)定的結(jié)果可以看出。非蛋白氮代謝產(chǎn)物不能很好的排出體外（對(duì)Cr排泄率增加，而U排泄率降低）這也從一個(gè)側(cè)面證實(shí)了患者的腎臟已經(jīng)有了一定水平的損壞。