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血清滅活遇到的問題

來源:上海研伴實(shí)業(yè)有限公司   2019年07月17日 16:24  

一、血清滅活問題。

 

1、問:加到培養(yǎng)基中的血清必須滅活嗎?

 

答:不是必須的,看做什么實(shí)驗(yàn)了。

 

2、問:Gibco胎牛血清滅活是56℃ 30分鐘嗎?

 

答:如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞,血清一般是不需要滅活的,這樣可以有效保存血清中的生長因子。 但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補(bǔ)體受體的細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞,血清是需要滅活,一般是56℃,30min。

 

3、問:我要做滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng),胎牛血清要滅活嗎?

 

答:進(jìn)口的一般都已滅活,國產(chǎn)的不一定,務(wù)必還是滅活一下再用較安全。

 

4、問:我用病毒上清轉(zhuǎn)染細(xì)胞,培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎?因?yàn)檠逯锌赡苡行┭a(bǔ)體和抗體,是不是會(huì)影 響轉(zhuǎn)染?我想未滅活的血清中含些抗體補(bǔ)體可能會(huì)和病毒相結(jié)合,影響轉(zhuǎn)染,正確嗎?細(xì)胞是單核細(xì)胞白血病細(xì)胞, 病毒是病毒包裝細(xì)胞PT67收集的病毒上清。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí),目的是什么?

 

答:血清一定要滅活,可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)以后再加血清。避免雜蛋白對(duì)病毒和宿主 結(jié)合過程的干擾,一般是2-6小時(shí),根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活,滅活的目的是將血清中的補(bǔ)體滅活 !這要根據(jù)實(shí)際情況而定,如果沒有把握那就滅活吧,也不麻煩56度半個(gè)小時(shí)。

 

5、問:(1)我買的是Gibco北美胎牛血清,要滅活嗎?有些說法是需要,有些說直接解凍后就可以加入到培 養(yǎng)基中;我配制*液,用的是D-PBS,有關(guān)系嗎?

 

答:關(guān)于血清的熱滅活,是很多人感興趣也存在一定爭議的話題。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行,因?yàn)橛袃蓚€(gè)作用,是滅活補(bǔ)體,第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實(shí)驗(yàn)者并沒有考慮熱處 理對(duì)血清中的生長因子、氨基酸等成分帶來的負(fù)面影響。

 

我在實(shí)驗(yàn)室處理血清的時(shí)候,有一次水浴箱在滅活過程中出現(xiàn)故障,溫度升高到80℃,血清變成了凝膠狀 ,我重新處理了另外一份血清,將兩份血清對(duì)比,發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56℃下滅活半小時(shí)以 上,肯定也會(huì)對(duì)里面的蛋白起到破壞作用。下次有機(jī)會(huì)我做個(gè)延長滅活時(shí)間的實(shí)驗(yàn)試試,看看到底有多大的影響。熱 滅活之后,血清放在四度冰箱久了,就會(huì)有沉淀產(chǎn)生,這常常會(huì)被認(rèn)為是微生物污染或者是黑膠蟲污染。為了驗(yàn)證到 底有沒有污染,常常又會(huì)把血清放置37℃溫育,但是血清中的蛋白會(huì)進(jìn)一步析出,后還是要做鏡檢,無菌培養(yǎng)試驗(yàn) ,和革蘭氏染色試驗(yàn),非常麻煩。

 

我看過一份資料,里面提到70%的實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為滅活是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間, 而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等。其中常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高 ,許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立,只有少數(shù)對(duì)血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效 性和必要性。有人比較過11個(gè)不同細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對(duì)6 個(gè)細(xì)胞株(HBAE,MDBK,Vero,成纖維細(xì)胞,MRC-5) 的生長帶來負(fù)面影響,三個(gè)細(xì)胞株(FOX-NY,MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響,而只有兩個(gè)細(xì)胞株(Balb/3T3, Sp2/0Ag14 hybrid),在熱滅活之后,細(xì)胞生長有輕微的改善。所以,在正常的操作下,熱滅活通常對(duì)細(xì)胞的生長沒 有明顯的促進(jìn)作用。

 

你可以摸索一下,血清從-20℃冰箱拿出來之后在常溫解凍,然后混勻分裝成兩份,一份滅活,一份不滅活 ,比較這兩種血清對(duì)細(xì)胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個(gè)過程多也就一個(gè)星期。同時(shí)你還要考慮 血清滅活與否對(duì)你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有沒有影響。

 

問:(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化,卻見血清比較混濁,有沉淀產(chǎn)生,這屬正常嗎?

 

答:正常。

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