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簡介
3D 生物打印被定義為細(xì)胞和生物相容性材料功能性 3D 結(jié)構(gòu)或人工組織模型。1 這項技術(shù)改變了組織工程領(lǐng)域，使得創(chuàng)建復(fù)雜的預(yù)定義設(shè)計的結(jié)構(gòu)成為可能，同時確?？芍貜?fù)性。幾種基于 3D 生物打印的方法已報告用于工程化各種組織，如軟骨、2 骨、3 以及皮膚再生。4 該技術(shù)也被用于創(chuàng)造新的臨床前腫瘤模型。事實上，作為 2D 細(xì)胞培養(yǎng)模型由于缺乏預(yù)測性而受到越來越多的質(zhì)疑， 3D 生物打印已成為一種替代方法通過處理不同的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)衍生分子，腫瘤微環(huán)境的建模 / 展示 (TME) 來規(guī)避這個問題。許多基于 3D 生物打印的腫瘤模型包括肺癌、5 乳腺癌和 6 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。7 這些模型在設(shè)計方面表現(xiàn)出優(yōu)勢，與其他策略相比具有靈活性和可重復(fù)性如 細(xì)胞球和類器官。 卵巢癌是一個重大的公共衛(wèi)生問題，3D 生物打印仍作為 卵巢癌模型仍在研究中。在此類腫瘤類型中，顯示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 與癌細(xì)胞發(fā)生密切相互作用，在癌癥侵襲和耐藥中發(fā)揮主要作用。8，9 因此 CAFs 是設(shè)計卵巢癌模型的關(guān)鍵。
優(yōu)勢
高內(nèi)涵篩選和瞬時轉(zhuǎn)染有助于表征和驗證 3D 生物打印實驗 • 瞬時基因表達(dá)是增加 3D 生物打印模型的多功能性的有力工具 • 多波長分析工具對于充分利用 3D 生物打印模型的強(qiáng)大功能進(jìn)行研究不同細(xì)胞類型群體在模型內(nèi)的相互作用是必需的在此應(yīng) 用說 明 中，3D 生物打印用于創(chuàng)建包含癌細(xì)胞 ( SKOV3 細(xì)胞 ) 和 CAF 成纖維細(xì)胞 ( MeWo 細(xì)胞 ) 的卵巢癌模型。使用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SKOV3 細(xì)胞和并用 CellTracker 和 Orange CMRA Dye (ThermoFisher) 將 MeWo 細(xì)胞染色。兩種細(xì)胞類型均包含在明膠 - 藻酸鹽 - 基于水凝膠以獲得用于形成圓柱形腫瘤樣結(jié)構(gòu)。模型的均相性以及這些腫瘤內(nèi)細(xì)胞分布的可重復(fù)性，使用 ImageXpress Pico 進(jìn)行評估成像系統(tǒng)。
結(jié)果和討論
如圖 1 所示，生物打印結(jié)構(gòu)成像顯示表達(dá) GFP 的 SKOV3 細(xì)胞和熒光染色的 MeWo 細(xì)胞均質(zhì)分布于明膠 - 藻酸鹽 基體 ( 圖 1A 和 B )。這非常重要，因為同質(zhì)細(xì)胞分布均勻分布在生物墨水中是 3D 打印過程中需要考慮的重要因素 12 此外，天然 TME 是已知包含多種緊密相互作用的細(xì)胞類型。13 因此，重現(xiàn)這一點至關(guān)重要，同時構(gòu)建體外腫瘤模型以促進(jìn)癌癥和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。
而腫瘤中應(yīng)結(jié)合多種細(xì)胞類型以更好地模擬 TME 異質(zhì) 性，每種細(xì)胞類型的數(shù)量及其比例需要加以控制以確?？芍貜?fù)性。ImageXpress Pico 是一個特別適合用于實現(xiàn)此類控制，因其可以快速輕松地捕獲多張顯微鏡圖像。 軟件 CellReporterXpress 允許對多個細(xì)胞進(jìn)行定量即使是厚樣品，也可使用 Z-stack 的最大投影實現(xiàn)。在此應(yīng)用說明中，此系統(tǒng)用于分析我們的生物打印腫瘤模型在細(xì)胞數(shù)量和比例方面顯示出良好的可重復(fù)性在 6 個生物打 印的結(jié)構(gòu)，SKOV3 細(xì)胞的平均數(shù)量 ( 細(xì)胞計數(shù) FITC ) 為 837 ± 200 ( 標(biāo)準(zhǔn)差 ≤ 25% )。對于 MeWo 細(xì)胞 ( 細(xì)胞計 數(shù) TRITC )，平均數(shù)量為 3264.50 ± 462 (StD ≤ 15%)。

圖 1 分析含有轉(zhuǎn)染 GFP 質(zhì)粒的 SKOV3 細(xì)胞和經(jīng) CellTracker Orange 染色的 MeWO 細(xì)胞的 3D 生物打印結(jié)構(gòu) CMRA 染料。A) 使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng) (4X，Z-stack) 采集的孔 B3 中 3D 生物打印結(jié)構(gòu)的 FITC 和 TRITC 圖像。B) 分析使用 CellReporterXpress 軟件創(chuàng)建的 FITC 和 TRITC 細(xì)胞計數(shù)的 掩膜。C) 樣品的 FITC 和 TRITC 通道中的平均細(xì)胞數(shù)量 (5 孔，染色和轉(zhuǎn)染 ) 和陰性對照 (3 孔，未染色和未轉(zhuǎn)染 )。D) 轉(zhuǎn)染效率的評估，使用 GFP 質(zhì) 粒和 jetOPTIMUS-Polyplus-transfection-transfection 試劑盒 (FITC 陽性細(xì)胞百分比 /TRITC 陽性細(xì)胞 )。

材料和方法
水凝膠制備
對于水凝膠制備，所需質(zhì)量的對明膠和海藻酸鈉粉末進(jìn)行稱重，在紫外線下 1 小時，然后溶解在 Dulbecco 改 良 EagleMedium 中混合lowest必需培養(yǎng)基 (MEM)，補(bǔ)充有 10% 胎牛血清。所得溶液為然后在磁力攪拌下在 37℃ 下 保持過夜，complete均質(zhì)化。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和染色根據(jù)制造商的說明，使 用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SKOV3 細(xì)胞。10 簡言之，適量的 DNA 稀釋至 jetOPTIMUS 緩沖液并適當(dāng)?shù)募尤?jetOPTIMUS 轉(zhuǎn)染試 劑。轉(zhuǎn)染溶液在室溫下保存 10 分鐘，然后添加到培養(yǎng)的 SKOV3 細(xì)胞中，以 60–80% 融合度培養(yǎng)在 T75 燒瓶中。 使 用 CellTracker Orange CMRA 染 料 (ThermoFisher) 對 MeWO 細(xì)胞進(jìn)行染色，按照制造商的說明。11 簡言 之，將染料溶解在 DMSO 中制備工作溶液，然后稀釋在 MEM 培養(yǎng)基中。將細(xì)胞在 37℃ 孵育 30 分鐘。 然后取出試劑溶液，替換為新鮮的complete培養(yǎng)基。

圖 2 用于對卵巢癌模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物打印和成像的方法示意圖。