Science綜述 | 深入揭秘空間組學(xué)革命，未來科學(xué)新篇章將展開！

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Science綜述 | 深入揭秘空間組學(xué)革命，未來科學(xué)新篇章將展開！

來源：北京澤匯商貿(mào)有限公司 2023年09月27日 13:04

在生物體中，細胞必須在三維組織中相互作用和組裝。每個細胞的位置與其內(nèi)在性質(zhì)一樣重要，可以用來確定組織在疾病中的功能或障礙。最近，在多重空間分子測量方面爆發(fā)的創(chuàng)新正在開啟生物學(xué)研究的新篇章，并使人們重新?lián)肀到y(tǒng)的復(fù)雜性。

空間組學(xué)有望通過同時測量物理組織結(jié)構(gòu)和分子特征，來改變生物學(xué)的許多領(lǐng)域并最終che底改變病理學(xué)。目前，大量新技術(shù)可以對基因和蛋白質(zhì)表達、基因突變、表觀遺傳標記、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因組組織進行空間分析。但空間組學(xué)技術(shù)的分辨率、靈敏度和通量水平截然不同，在易于采用、與不同樣品類型的兼容性、商業(yè)可用性、前期投資和每個樣品的成本方面也存在很大差異。在這個不斷發(fā)展的領(lǐng)域，選擇zuihao的技術(shù)來解決特定的生物挑戰(zhàn)至關(guān)重要。

8月4日，劍橋大學(xué)科學(xué)家在《Science》撰寫題為“The dawn of spatial omics”的綜述文章，全面梳理了空間組學(xué)技術(shù)的豐富種類，闡明它們各自的原理、優(yōu)勢和局限性，并就空間組學(xué)目前面臨的挑戰(zhàn)提供了見解。

zui薪一代空間組學(xué)分析工具

1. 多重抗體成像

免疫組織化學(xué)（IHC）和原位雜交（ISH）方法已使用50多年。空間組學(xué)技術(shù)可以使用質(zhì)譜（MS）等非顯微方法來檢測分析物，執(zhí)行染色和染料去除循環(huán)以達到所需的復(fù)雜性，或者利用高通量DNA測序和條形碼的力量。

更新的質(zhì)譜流式細胞技術(shù)（MC），基于與同位素純鑭系金屬綴合的抗體檢測，具有非常高的信噪比（SNR），是成像質(zhì)譜流式細胞技術(shù)（IMC）和多重離子束成像（MIBI）的基礎(chǔ)。然而受到足夠純金屬的可用性的限制，可實現(xiàn)的復(fù)雜性在大約50個物種。

多重抗體成像的另一種方法是基于在重復(fù)成像周期中檢測常規(guī)標記的熒光抗體。在部分方法中，所有抗體立即與樣品結(jié)合，并通過二級探針循環(huán)進行檢測?？偟膩碚f，它們相對于MS具有更大的數(shù)據(jù)生成能力。對于涉及大量樣本收集的項目來說，循環(huán)成像方法可能是最可行的替代方案。

2. 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）和基因組學(xué)

這系列技術(shù)的最終目標是，以亞細胞分辨率測量整個組織樣本中每個基因和基因亞型的豐度。目前，還沒有任何技術(shù)能夠達到這一目標?？臻g基因組分析基于四種主要策略。

2.1 顯微切割和光隔離

顯微切割可能是通過物理分離從特定區(qū)域純化生物分子，來為分子圖譜添加空間信息的蕞明顯方法。激光捕獲顯微切割（LCM）通常用于分離小區(qū)域（數(shù)十至數(shù)百個細胞）以進行RNA-seq，并且可以達到單細胞分辨率。

最近的研究使用光來空間選擇要剖析的區(qū)域。光可用于觸發(fā)逆轉(zhuǎn)錄（RT），切割報告基因，貼上純化標記，或去除測序接頭連接的阻礙物（adaptor）。光還可以觸發(fā)DNA條形碼或條形碼組合的附著，通過驅(qū)動其交聯(lián)或雜交到組織。然后使用條形碼將讀取重新分配給這些區(qū)域。

顯微切割技術(shù)能提供非常深入的分析，幾乎達到批量測序水平，并允許將感興趣的區(qū)域從單個細胞定制到整個區(qū)域。但是它們的通量相對較低。

2.2 多循環(huán)原位雜交

循環(huán)雜交的方法是單分子FISH（smFISH）的后代，這是一組將組織中的單個mRNA分子解析為亞衍射熒光點的技術(shù)。為了實現(xiàn)檢測，需要將多個探針與相同的mRNA分子結(jié)合。smFISH通常被認為是RNA定量方法中的“金標準”，因為它可以檢測非常低豐度的轉(zhuǎn)錄本，從它衍生的空間分析技術(shù)往往具有出色的靈敏度。

MERFISH和seqFISH+是目前可用的兩種主要的基于雜交的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，都已擴展到全轉(zhuǎn)錄組水平，成功用于研究不同器官和組織中的空間基因表達，適合通過寡聚抗體同時檢測mRNA和蛋白質(zhì)。兩者在靈敏度、通量和優(yōu)缺點方面實際上非常相似，但在操作和條形碼方案細節(jié)方面存在一些技術(shù)差異。

還有其他一些技術(shù)如osmFISH、Saber-FISH、Clamp-FISH、SCRINSHOT、EEL-FISH等，其中許多方案可同時分析數(shù)千個基因和數(shù)十種蛋白質(zhì)。技術(shù)復(fù)雜且實施起來費力，限制了該類技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

2.3 原位測序

該方法系列的前提是，對組織切片內(nèi)原位執(zhí)行高通量測序，蕞常用的測序技術(shù)是連接測序而不是合成測序。共同步驟是通過對檢測到的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的圓形模板進行滾環(huán)擴增（RCA），來生產(chǎn)DNA“納米球”（rolony）。每個mRNA分子都會產(chǎn)生一個單獨的rolony，從而可以對轉(zhuǎn)錄本進行定量，蕞大讀取長度約為30個核苷酸。

這些方法包括基于與mRNA雜交的掛鎖DNA探針的ISS，和通過cDNA分子的環(huán)化產(chǎn)生RCA擴增子的FISSEQ，它們也迅速催生了多種具有更高效率和改進特征的衍生方法，如BaristaSeq。最近，均已與擴展顯微鏡化學(xué)相結(jié)合，效率和SNR均得到了顯著提高，如ExSeq。

基于FISH和基于原位測序的方法有一個共同點：最終通過組織的高分辨率顯微鏡成像進行檢測，并通過有效計數(shù)單個mRNA分子來測量基因表達。單分子顯微鏡非常具有挑戰(zhàn)性，需要極其精確的儀器和進程，檢測靈敏度也會因細胞大小而產(chǎn)生偏差。

2.4 空間條形碼

在ST中，通過使用微陣列打印技術(shù)，將有序的寡核苷酸陣列沉積在載玻片上，然后將薄的組織切片放置在陣列上，進行透化以使細胞RNA擴散到帶有條形碼的寡核苷酸，并原位反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生空間索引的cDNA，然后產(chǎn)生文庫并進行測序。關(guān)鍵優(yōu)勢是能夠產(chǎn)生長測序讀數(shù)、不依賴復(fù)雜的成像儀器、高速、用于并行化，極大地促進了其商業(yè)應(yīng)用。然而，也存在一些缺點，包括分辨率低（目前為50至100 μm）、每個樣品的成本高以及RNA捕獲效率低。

Slide-seq和HDST技術(shù)將帶有條形碼的Poly（T）引物附著到納米珠上，然后將珠子包裝在粘性載玻片（Slide-seq）或微孔圖案載玻片（HDST）上，達到更高的空間密度（Slide-seq為10 μm，HDST為2 μm）。Slide-seq、HDST和Slide-tags能夠以與單細胞大小相當?shù)姆直媛蔬M行分析，但這是以更復(fù)雜的操作和試劑設(shè)置以及更低的RNA捕獲效率為代價的。改進方法如Seq-Scope、Stereo-seq和PIXEL-seq都具有相對較高的捕獲效率，與scRNA-seq持平或略高。此外，還有DBIT-seq。

空間條形碼技術(shù)與批量測序相結(jié)合非常成功。商業(yè)選項的可用性、高精度儀器的不依賴以及與現(xiàn)有工作流程的兼容性降低了進入門檻，數(shù)據(jù)分析也相當簡單。然而，空間條形碼相對于樣本的低分辨率和隨機定位意味著信息有時會混淆結(jié)果。

選擇的平衡

方法的選擇取決于每個特定研究的具體需求，分辨率、通量、易于實施、穩(wěn)健性和成本是關(guān)鍵變量。

對于蛋白質(zhì)分析，主要決定是投資IMC-MIBI生態(tài)系統(tǒng)還是選擇環(huán)狀免疫熒光方案。IMC的分辨率相對較粗，通常不足以檢測細胞核和膜以外的任何亞細胞結(jié)構(gòu)。MIBI提供更高的分辨率，但處理速度更慢。環(huán)狀免疫熒光成本較低，提供更高的通量，辨率要高得多，具有較低的SNR。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域的考慮要復(fù)雜得多。基于成像的方法可以提供非常高的分辨率，但這也使它們變慢。雜交方法具有更好的靈敏度，但往往會產(chǎn)生較弱的熒光信號，還需要針對不同的組織重新優(yōu)化，在相對較薄的切片（10至20μm）上表現(xiàn)蕞佳。而原位測序方法可以對更厚的樣品（高達100μm左右）進行成像，但表現(xiàn)出蕞低的靈敏度。

分辨率和通量也是某些基于條形碼的方法需要考慮的關(guān)鍵參數(shù)。在大多數(shù)情況下，這些方法無法將空間條形碼與特定細胞相關(guān)聯(lián)。目前使用蕞廣泛的技術(shù)ST，其分辨率較低，使得詳細分析空間鄰域變得更加困難。此外，靈敏度相對較低，并且每個樣品的成本通常高于其他方法。然而，條形碼方法在通量方面具有相當大的優(yōu)勢。

當只需要對幾個空間位置進行深度剖析時，應(yīng)考慮激光捕獲解剖或空間標記方法。這些方法通常更容易實現(xiàn)，并且可通過各種批量分析方法直接純化選定材料進行分析。

兩大挑戰(zhàn)

1. 分析的挑戰(zhàn)：從大數(shù)據(jù)到有用數(shù)據(jù)

數(shù)據(jù)采集通常被認為是空間組學(xué)方法中最困難的步驟，但數(shù)據(jù)操作、分析和可視化同樣重要。圖像配準是一個難題，巨大數(shù)據(jù)量使空間分析變得更加復(fù)雜。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法需要解碼步驟，這些處理難以標準化和優(yōu)化。最近，SpaceTx聯(lián)盟做出了巨大的努力，發(fā)布了一組成功適用于大多數(shù)方法的Python模塊——Starfish。

圖像分割是生物成像和計算機視覺的核心問題，并且在過去幾年中受益于人工智能（AI）和深度學(xué)習(xí)的快速發(fā)展。定義細胞質(zhì)膜邊界是一項更復(fù)雜的任務(wù)，即使使用AI模型也無法產(chǎn)生有效的分割。

空間條形碼方法繞過了大多數(shù)圖像分析要求，但條形碼讀數(shù)映射到的“位置”不一定對應(yīng)于特定的單個細胞。為分解數(shù)據(jù)設(shè)計的工具可以提供良好的結(jié)果，如Seurat、ScateR、Scanpy和Monocle軟件包，但數(shù)據(jù)生成的細微差別可能會導(dǎo)致偏差。專用軟件包通常將原始數(shù)據(jù)的直接可視化與逐個特征矩陣的分析相結(jié)合，還提供商業(yè)選項，例如，GiottoVitesSce、Histocat、Cytomapper、SquidPy等。

盡管目前的工具能對空間數(shù)據(jù)進行分析，但無法有效利用空間剖析方法最重要的特征：空間。可以通過配體-受體分析來補充，這是一種在分解的scRNA-seq中引入的細胞-細胞功能相互作用的測量方法。

2. 實驗設(shè)計的挑戰(zhàn)

一種應(yīng)用是在生理和病理條件下識別組織內(nèi)的新細胞類型和狀態(tài)。這是人類細胞圖譜項目公開的目標，該項目現(xiàn)在正轉(zhuǎn)向空間組學(xué)技術(shù)。這些方法可以揭示傳統(tǒng)細胞類型定義未解釋的基因或蛋白質(zhì)表達的殘余異質(zhì)性，并將其與空間位置相關(guān)聯(lián)。另一個問題是不同細胞類型的共定位，是否影響表達譜或與組織功能或疾病結(jié)果相關(guān)。這是最近幾個大型項目的重點，例如研究腫瘤如何進化以及對治療的反應(yīng)。同時分析許多基因和蛋白質(zhì)的能力也有助于發(fā)現(xiàn)特定空間生態(tài)位的新標記。

使用空間組學(xué)方法來表征細胞類型的一個挑戰(zhàn)是在每個位置測量的特征數(shù)量有限。克服這一限制的一種策略是，將空間測量與分解的單細胞方法相結(jié)合。

重復(fù)是該領(lǐng)域大部分的核心問題。當研究具有刻板組織的樣本時，獲取多個重復(fù)并平均結(jié)果相對簡單，但這對于具有高度異質(zhì)且不一致的空間結(jié)構(gòu)的病理組織來說是一個挑戰(zhàn)。更復(fù)雜的是，隨著數(shù)據(jù)分辨率的提高，即使在具有看似可重復(fù)結(jié)構(gòu)的組織中，樣品之間的異質(zhì)性也暴露出來。

未來展望

我們?nèi)蕴幱诳臻g組學(xué)時代的黎明。隨著時間的推移，空間分析方法將變得更快、更可靠、更強大。這可能會與更廣泛的商業(yè)儀器和試劑同時提供。

剖析深度可能會繼續(xù)增加，現(xiàn)有技術(shù)將進一步擴展到更廣泛的測量范圍，基因組和表觀基因組測量也越來越多地在空間上進行，空間多組學(xué)技術(shù)將興起，模仿分解的單細胞技術(shù)的演變。最后，該領(lǐng)域?qū)⒏咏嬲?/strong>3D輪廓。

空間組學(xué)已經(jīng)為多個領(lǐng)域提供了實質(zhì)性和多樣化的見解，包括動物發(fā)育和大腦結(jié)構(gòu)以及與患者結(jié)果相關(guān)的腫瘤微環(huán)境（TME）特征。我們正處于空間組學(xué)革命的開端，但進展正在以驚人的速度發(fā)生，也將為闡明許多生物學(xué)問題做出重大貢獻。

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