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寬場顯微成像通常是活細(xì)胞成像的，因為它能夠更快、更溫和地成像。的寬場顯微成像使用 LED 光源和濾光片組。盡管有很多濾光片都可以用于各種不同的熒光團(tuán)組合，但是為了獲得用多個熒光團(tuán)標(biāo)記的樣本的正確圖像，需要考慮多個因素。

大多數(shù)用于活細(xì)胞成像的熒光團(tuán)都具有寬發(fā)射光譜。這一事實通常意味著各個探測通道之間會出現(xiàn)串?dāng)_現(xiàn)象，例如，您會在紅色探測通道中看到來自綠色通道的一些發(fā)射光。在活細(xì)胞成像實驗中使用多個標(biāo)記時，熒光光譜重疊現(xiàn)象很常見，因此為了確?？吹较胱R別的細(xì)節(jié)，可以使用窄帶濾光片。但是，這種方法會導(dǎo)致靈敏度下降并影響結(jié)果，因為活細(xì)胞中的熒光團(tuán)信號水平通常較低，尤其是對于靶標(biāo)豐度稀疏的樣本或以內(nèi)源性水平表達(dá)的樣本。使用更多激發(fā)光來抵消靈敏度下降通常不可行，因為這種方法對樣本的危害性會增加（即光毒性增加）。

在活細(xì)胞實驗中，高速采集通常至關(guān)重要，特別是在研究快速動態(tài)過程時，如囊泡觀察。使用濾光片會導(dǎo)致速度受限，因為在改變每種顏色的濾光片組時必須依次成像。按順序采集圖像比同時采集圖像需要更多時間，因此在采集過程中可能會錯過樣本的快速運動，因為從一個圖像到下一個圖像時每種顏色都有更長的時間間隔。此外，當(dāng)兩種或多種顏色之間的直接比較至關(guān)重要時，例如在上述囊泡觀察實驗中：信號甚至可能在兩次熒光團(tuán)采集之間已經(jīng)移動，從而加大數(shù)據(jù)解釋的難度。

研究活細(xì)胞中多個探針之間的相互作用而獲得的大量信息可提供生理學(xué)方面更重要的結(jié)果，因此人們開發(fā)了多種方法來拆分復(fù)雜的混合發(fā)射光信號。

為了能夠使用多個標(biāo)簽，以便從一個樣本中獲得更深入的認(rèn)識，您可以使用光譜圖像信息線性拆分方法，它可以分析每個熒光團(tuán)對總信號的貢獻(xiàn)。要進(jìn)行線性光譜拆分，必須為所有可能的參考光譜混合方式計算未知光譜與參考光譜之間的最小差值 ⁽¹⁾。這種方法通常用于對多種顏色成像，即使它們重疊。但是在寬場顯微成像中，您仍可能遺漏關(guān)鍵信息，因為必須對樣本中每個熒光團(tuán)依次成像，這會導(dǎo)致速度受限。

有一種方法可以快速拆分多種顏色，而不必?fù)?dān)心采集期間光譜重疊，也無需學(xué)習(xí)復(fù)雜的光譜拆分方法。

最近發(fā)表的一些文章介紹了一種基于相量的光譜拆分方法 ^{(2, 3)}。光譜相量分析可將每個像素的光譜成分轉(zhuǎn)換為二維圖中的一個位置。這樣就可以利用簡單的數(shù)學(xué)方法即時、可靠地分離不同染料的發(fā)射光。此外，它還可以僅基于光譜而不是強(qiáng)度來增加濾光——從而保留圖像的細(xì)微細(xì)節(jié)，同時減少可能會影響線性光譜拆分的噪聲。由于實際上消除了串?dāng)_以及自發(fā)熒光等干擾因素，選擇合適的熒光探針組合不再是問題，因此以這種方式成像可以更輕松地設(shè)置多通道活細(xì)胞成像實驗。