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實驗原理:

傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎(chǔ)。當細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作。

實驗步驟:

1.入無菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒雙手。

2.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預熱。

3.超凈臺臺面應整潔，用0.1%新潔爾滅溶液擦凈。

4.打開超凈臺的紫外燈照射臺面20min左右，關(guān)閉超凈臺的紫外燈，打開抽風機清潔空氣，除去臭氧。

5.點燃酒精燈;取出無菌試管，巴斯德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。

6.將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

7.倒掉培養(yǎng)細胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2-3mLHanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量yi酶涮洗一下。

8.每個大培養(yǎng)瓶加入1mLyi酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞脫離yi酶，然后將yi酶倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。

9.加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7~10mL/大瓶，3~5mL/小瓶)制成細胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO?氣體的進入，將培養(yǎng)瓶放回CO?培養(yǎng)箱。

10.對懸浮培養(yǎng)細胞，步驟7-9不做?？蓪⒓毎麘乙哼M行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。