惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的誘發(fā)和培養(yǎng)方法！

惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的誘發(fā)和培養(yǎng)方法！

細(xì)胞培養(yǎng)已成為研究癌癥的發(fā)病機(jī)制和腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的常用方法。細(xì)胞培養(yǎng)提供的模型系統(tǒng)中，實(shí)驗(yàn)變量可被嚴(yán)格控制，較使用整體動(dòng)物更省時(shí)、價(jià)廉且易于操作。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域取得的理論和技術(shù)進(jìn)展的基礎(chǔ)上，細(xì)胞培養(yǎng)體外系統(tǒng)為腫瘤研究提供了新的方法和應(yīng)用領(lǐng)域，體外研究結(jié)果也為進(jìn)一步的體內(nèi)研究提供可借鑒的資料。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，將為細(xì)胞惡變機(jī)制研究提供新的平臺(tái)，并將促進(jìn)腫瘤的基礎(chǔ)研究與臨床防治研究。

本章主要介紹腫瘤學(xué)研究和臨床實(shí)踐中涉及細(xì)胞培養(yǎng)的一些成熟技術(shù)方法。關(guān)于腫瘤的生物治療技術(shù)，早在1985年美國國家癌癥中心已經(jīng)將生物治療正式列入腫瘤*的第四大模式。生物治療從臨床上廣泛應(yīng)用LAK,TIL細(xì)胞開始出現(xiàn)“火熱”，中間曾由于濫用現(xiàn)象而走入過一段低谷，發(fā)展到今天又迎來了一個(gè)應(yīng)用CIK細(xì)胞的高潮。由于過繼*的優(yōu)點(diǎn)決定了它在腫瘤生物治療中的地位，因?yàn)槟[瘤特異性抗原的研究仍未取得實(shí)質(zhì)性的突破，腫瘤疫苗和靶向治療制劑的使用仍難達(dá)到理論上的期望值，恐怕過繼*在今后一段時(shí)間里仍將是腫瘤生物治療中重要的手段。關(guān)于LAK, TIL與CIK細(xì)胞的制備與功能檢測等。

節(jié)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的誘發(fā)和培養(yǎng)

癌變，即細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，是一個(gè)發(fā)生在體內(nèi)的過程，在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，也可以用人工方法誘發(fā)。人工誘發(fā)體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，是研究癌變?cè)淼闹匾椒ǎ鋬?yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好，可用于研究各種可致癌因素的作用，細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，能夠進(jìn)行直接觀察和做各種分析。人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的體外癌變模型，不僅在理論研究中有重要作用，亦可應(yīng)用于檢測環(huán)境中的致癌物。

一、人工誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，用化學(xué)、物理和生物等各種致癌物可人為地誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。條件是要讓細(xì)胞直接受到致癌物的作用，從細(xì)胞接觸致癌物到發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化一般需兩周到三個(gè)月的時(shí)間。

（一）細(xì)胞轉(zhuǎn)化基本過程

⒈誘發(fā)也稱啟動(dòng)，是致癌物或誘變劑誘發(fā)DNA損傷的過程。誘發(fā)因素可分為物理因素，例如，射線；化學(xué)物質(zhì)，即致癌化合物以及生物因素，例如某些病毒（EB病毒、人瘤病毒等）、等。應(yīng)用射線時(shí)，可直接照射細(xì)胞，在用致癌化學(xué)物或病毒時(shí)，需把這些物質(zhì)加到培養(yǎng)物中，使之與細(xì)胞直接接觸，但細(xì)胞受致癌物作用時(shí)間過長，或致癌物劑量過大，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此應(yīng)用致癌物的劑量和作用時(shí)間要控制在能使細(xì)胞傷而不死，處于DNA合成階段的細(xì)胞易受到致癌物損傷，因此讓致癌物接觸細(xì)胞的時(shí)間不宜少于6小時(shí)，但也不得超過48小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)中常用的是致癌化學(xué)物，可分為直接致癌物與間接致癌物。直接致癌物如N-甲基-N’-硝基-N-亞( N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ; MNNG）能直接損傷DNA誘發(fā)癌變；間接致癌物又稱前致癌物，需經(jīng)某些酶的活化，形成終末致癌物后，才能發(fā)生致癌的作用，終末致癌物具有強(qiáng)的親電子性質(zhì)，易與細(xì)胞核中含電子多的DNA,RNA和蛋白質(zhì)等相結(jié)合，從而導(dǎo)致DNA的損傷，發(fā)生轉(zhuǎn)化過程中的啟動(dòng)作用。

⒉DNA的損傷與修復(fù)DNA損傷后可進(jìn)行自我修復(fù)。修復(fù)是一復(fù)雜的過程，存在著不同修復(fù)機(jī)制和產(chǎn)生不同的結(jié)果。無誤性的修復(fù)可使損傷DNA復(fù)原，但錯(cuò)誤性修復(fù)能引起DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。當(dāng)DNA損傷后如發(fā)生了錯(cuò)誤性修復(fù)，而這種變化被固定下來即能引起不可逆的改變，標(biāo)志著DNA發(fā)生了突變。從啟動(dòng)到損傷被固定下來，大約需24～48小時(shí)完成。

⒊發(fā)展和表現(xiàn)細(xì)胞DNA受損和被固定后，通過細(xì)胞的反復(fù)增殖，使細(xì)胞損傷進(jìn)一步得到發(fā)展和表現(xiàn)。受到一定劑量致癌物處理的細(xì)胞群，并非所有細(xì)胞都一定受到損害。受到誘發(fā)并進(jìn)入轉(zhuǎn)化發(fā)展階段的細(xì)胞僅是一小部分，這些細(xì)胞稱為癌前細(xì)胞（precancerouscell)。它們生長在那些未受損的正常細(xì)胞之中，這兩類細(xì)胞大約共同經(jīng)過12～15個(gè)細(xì)胞周期的增殖以后，可能細(xì)胞已相互匯合融合成片。正常細(xì)胞不再分裂，但那些散在的前癌細(xì)胞卻隨著轉(zhuǎn)化而不斷發(fā)展，細(xì)胞匯合后不發(fā)生接觸抑制，仍繼續(xù)分裂增殖，并由于數(shù)量的增多而堆積起來，形成明顯可見的轉(zhuǎn)化灶。

（二）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法

【材料】

⒈實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)需選用合適的細(xì)胞，來源主要分以下兩類

⑴原代細(xì)胞：原代培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞易于制備，細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后也容易識(shí)別，動(dòng)物和人的原代培養(yǎng)細(xì)胞皆可應(yīng)用。動(dòng)物細(xì)胞以倉鼠胚胎成纖維細(xì)胞（embryonic fibroblast,EFs）較好，人原代細(xì)胞取自胚胎，小兒和成人真皮等。

⑵傳代細(xì)胞系：BALB/3T3,C3H10T1/2,BHK-21,NIH3T3,V79細(xì)胞株等均可。這些細(xì)胞的共同特點(diǎn)都已獲得了無限生長的能力，變成了傳代細(xì)胞系，也失去了二倍體核型，說明這些細(xì)胞都已發(fā)生了一定程度遺傳變化，但卻保持著正常細(xì)胞的接觸抑制特征，而且接種同源動(dòng)物體內(nèi)無致癌性。

⒉培養(yǎng)液與試劑

⑴*培養(yǎng)液：85％高糖DMEM；15% FBS;O.1mM NEAA;2Mm/L*。

⑵低血清培養(yǎng)液：95％高糖DMEM;5% FBS;O.1mM NEAA;2Mm/L*。

⑶消化液：0.25% Trypsin-0.02% EDTA.

⑷凍存液：90% FBS;10% DMSO。

⑸Hanks液。

⑹MNN溶液。

【方法】

用原代細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。多選用倉鼠13天的胚胎EFs。

⒈取數(shù)個(gè)或所有同窩胚胎，去頭和內(nèi)臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用消化液37℃消化30分鐘，吹打數(shù)次后過濾,1000r/min，離心5分鐘。去除上清消化液，加Hanks洗1次，沉淀細(xì)胞加入培養(yǎng)液，制備5x105/ml細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)2～3天，能迅速長滿瓶。

⒉選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，液氮凍存?zhèn)溆茫▊鞔^多不利于細(xì)胞轉(zhuǎn)化）。

⒊致癌物處理凍存細(xì)胞解凍后，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，每瓶含細(xì)胞（1～3)x105。待細(xì)胞生長進(jìn)入指增*時(shí)，向培養(yǎng)瓶中加入致癌劑。致癌劑常用MNNG，劑量為1～3ug/ml營養(yǎng)液，在37℃孵箱中培養(yǎng)12～48小時(shí)。

⒋棄掉MNNG作用液，用溫PBS洗1～3次，加入培養(yǎng)液繼續(xù)置孵箱培養(yǎng)2～3周（如用人細(xì)胞需1～3個(gè)月），然后更換培養(yǎng)液，用含5％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。低血清培養(yǎng)液不利于正常細(xì)胞生長，但已轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞仍可增殖，易形成轉(zhuǎn)化灶。

⒌轉(zhuǎn)化灶的形成和分離用致癌物處理過的細(xì)胞于10天后，如果轉(zhuǎn)化成功，在正常細(xì)胞之間可產(chǎn)生數(shù)量不等的轉(zhuǎn)化灶。轉(zhuǎn)化灶由密集的重疊細(xì)胞群組成；灶的大小不等，小者由幾十或幾百個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，大者肉眼可見。

⒍轉(zhuǎn)化現(xiàn)象出現(xiàn)后，為獲得純的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群，應(yīng)把轉(zhuǎn)化灶分離出來。轉(zhuǎn)化灶分離可用兩種方法：

⑴刮除法：先在有轉(zhuǎn)化灶處瓶壁上用蠟筆圈出記號(hào)，再用膠皮刮刮掉未轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞，向瓶內(nèi)加入PBS沖洗掉刮除后，加0.25 % Trypsin少許置37℃孵箱中消化5～10分鐘，待細(xì)胞松散后，棄掉消化液，加入新鮮的含10％～20％小牛血清培養(yǎng)液，以終止殘余*消化作用，用吸管反復(fù)吹打轉(zhuǎn)化灶，使之脫離瓶壁成細(xì)胞懸液，再置37℃孵箱。

⑵消化法：先在瓶壁上用蠟筆圈出轉(zhuǎn)化灶，棄掉瓶內(nèi)培養(yǎng)液，選生長良好的轉(zhuǎn)化灶，用不銹鋼小環(huán)或無毒硅橡膠圈沾少許無菌明膠（不用亦可）套在轉(zhuǎn)化灶上；向圈中滴0.25% Trypsin充分消化后，用彎頭吸管把*與細(xì)胞一同吸出接種入新培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)加營養(yǎng)液少許；置孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。數(shù)日后轉(zhuǎn)化細(xì)胞迅速增殖成新的細(xì)胞群。

【結(jié)果】

⒈高倍鏡下觀察，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，如系成纖維細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，胞體變大成類多角形，生長無方向性，失去接觸抑制，向三度空間伸延，細(xì)胞相互重疊。在轉(zhuǎn)化灶的邊緣轉(zhuǎn)化細(xì)胞與正常細(xì)胞界限分明，形態(tài)區(qū)別非常明顯。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，形態(tài)上不如成纖維細(xì)胞差別大，需仔細(xì)辨認(rèn)。

⒉無限細(xì)胞系用BALB/3T3或C3 H10T1/2細(xì)胞等，比原代細(xì)胞操作更簡單，而且成功率高。轉(zhuǎn)化程序與原代培養(yǎng)細(xì)胞相同。

【注意事項(xiàng)】

MNN溶液，有毒，用時(shí)注意防止污染環(huán)境；避光陰涼處保存，實(shí)驗(yàn)用液現(xiàn)配現(xiàn)用。用MNNG處理細(xì)胞不宜超過48小時(shí)。

（三）轉(zhuǎn)化細(xì)胞的檢測

用誘變劑或致癌劑誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞群后，為確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的性狀，需進(jìn)一步做一系列的實(shí)驗(yàn)分析。

⒈細(xì)胞生物學(xué)一般性狀包括細(xì)胞形態(tài)、生長速度、倍增時(shí)間等。

⒉細(xì)胞遺傳學(xué)特征核型分析，染色體組型畸變和標(biāo)志染色體的有無。

⒊惡性測試侵襲性試驗(yàn)，軟瓊脂培養(yǎng)，異體動(dòng)物接種，凝集試驗(yàn)等。

以上測試中重要的為第3項(xiàng)，說明發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是否為惡性轉(zhuǎn)化。

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