土壤微生物研究取樣的準(zhǔn)備工作與操作方法！

土壤微生物研究取樣的準(zhǔn)備工作與操作方法！

一、準(zhǔn)備工作

⒈制定采樣計劃

采樣前需要確定好實驗?zāi)康?、采樣樣地、樣品?shù)量、采樣方法、采樣工具、交通、線路以及天氣等情況。通常需要準(zhǔn)備一份采樣報告，詳細(xì)記錄采樣的具體情況，例如采樣日期、時間，采樣點詳細(xì)位置（GPS定位），天氣狀況（氣溫、降水、濕度、云等）等信息。

⒉樣地資料收集

確定采樣點后，可以提前收集、了解該地的土壤類型、天氣資料、水文資料等信息。實際采樣前根據(jù)所收集的資料進(jìn)行現(xiàn)場勘查，終確定確切的采樣點。

⒊采樣器具

⑴采樣器具

A. 工具類：土鉆、鐵鏟、篩子、鑷子、藥匙、刷子以及適合特殊采樣要求的工具等。

B. 器材類：50 mL 無菌管、50 mL 無菌瓶、美國parafilm封口膜、卷尺、GPS、坡度儀、土壤比色卡、樣品箱（具冷藏功能或含干冰）、冰袋、樣品袋、一次性手套、75%酒精、滅菌棉球、無菌水、液氮、干冰等。

C. 文具類：樣品標(biāo)簽、記號筆、采樣記錄表等。

D. 安全防護(hù)用品類：工作服、工作鞋、雨具、安全帽、藥品箱等。

⑵注意事項

A.采樣工具和盛放土壤樣品的容器必須提前滅菌（錫箔紙包裹，高壓蒸汽滅菌后，120℃烘箱過夜），避免外源物質(zhì)干擾；

B.避免使用吸水、會釋放溶劑或增塑劑等物質(zhì)的器具來盛放土壤樣品。

二、土壤取樣方案

⒈位置選擇

根據(jù)研究目的，進(jìn)行采樣點的選擇，采樣點的選擇應(yīng)遵循以下原則：

A.采樣點土壤類型特征明確，地形相對平坦、穩(wěn)定，植被良好；

B.坡腳、洼地等具有從屬景觀特征的地點不宜設(shè)置采樣點；

C.城鎮(zhèn)、住宅、圍墻、道路、溝渠、田埂、糞坑、堆肥點、墳?zāi)沟鹊厝藶楦蓴_大，可能造成土壤特性錯亂，使土壤失去代表性，不宜設(shè)置采樣點；

D.采樣點離鐵路、公路至少300 m以上；

E.采樣點以剖面發(fā)育完整、層次較清楚、無侵入體為準(zhǔn)，不宜在水土流失嚴(yán)重或者表層土被破壞處設(shè)置采樣點。

F.不宜在多種土類、多種母質(zhì)交錯分布、面積較小的邊緣地區(qū)布設(shè)采樣點。

注意事項：確定采樣點后可以使用精準(zhǔn)地圖或者GPS進(jìn)行采樣點定位，或者在采樣點進(jìn)行標(biāo)記，便于以后重復(fù)取樣或者進(jìn)行比較試驗。

⒉取樣樣方設(shè)置

土壤橫向取樣方法示意圖：

⒊土壤取樣操作方法

⑴普通土壤（Bulk Soil）樣本取樣方法

A. 移除土壤表面覆蓋物，包括植物、苔蘚、可見根系、凋落物以及可見的土壤動物等；

B. 對采樣器使用酒精棉球擦拭，待酒精揮發(fā)*后，可使用采樣樣方處土壤浸潤采樣器。后續(xù)每次更換樣方均需重復(fù)此步驟；

C. 同一樣方采取多點取樣（建議4-5個取樣點等量均勻混合為一個樣本），去除樣品中的植物、可見動物以及石粒等，然后根據(jù)土壤情況，選擇是否過篩：①*過2 mm篩；②一些有機(jī)質(zhì)（如粗腐殖質(zhì)或泥炭等）不能通過2mm篩，此時可以選擇過4-5 mm篩；③如果土壤粘度太大或者含水量太高，可以選擇不過篩。

D. 將混合好的土壤樣本，分裝多份（3-5份備份樣本），每份3-5 g，標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍（如果條件不允許，可置于裝有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運回實驗室），隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于測定土壤微生物；另外留出一部分土壤，用于測定土壤理化指標(biāo)（如有機(jī)質(zhì)、全氮、礦質(zhì)元素等）。

⑵根際土壤（Rhizosphere soil）樣本取樣方法

①作物類（含草地等矮小植物）根際土壤取樣方法：

A. 采集植物植株（多點取樣法），去除根部大塊土壤，置于裝有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運回實驗室；

B. 無菌工作臺中，晃動植物根部，去除根部松散的土壤后，使用無菌刷子從根部收集殘留土壤，或?qū)χ参锔渴褂脽o菌水（或PBS緩沖液）振蕩（詳細(xì)參數(shù)參考引用文獻(xiàn)）洗滌植物根系，洗滌液進(jìn)行12000 g離心10 min以上收集沉淀（或過0.22 μm濾膜，收集濾膜）；

C. 同一樣方多點取樣的根際土壤樣本等量混合均勻，標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

②林木類根際土壤取樣方法：

A. 使用土轉(zhuǎn)采集地面下10-20 cm根際土壤，置于裝有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運回實驗室；

B. 視情況，選擇2-5 mm孔徑無菌篩網(wǎng)過篩；

C. 同一樣方多點取樣獲得的土壤樣本等量混合均勻，標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

（Nature, 2013）

⒋樣品存儲條件

A. 避免樣品反復(fù)凍融，以保證恒定低溫效果；

B.注意樣品在實驗室保存和分析過程中的密封性，以免凝結(jié)的水汽或者其他污染源對樣品造成污染。

三、樣本寄送

A. DNA：總量 > 500 ng，濃度 > 20 ng/µl，無明顯降解，土壤：2 g；

B. 單次送樣樣本量需 ≥ 20個，送樣管（凍存管）務(wù)必標(biāo)清樣品編號，管口使用Parafilm封口膜密封（防止樣本間交叉污染），并將填寫完整的送樣訂單用自封袋密封后，隨同樣品一起使用干冰運輸寄送至公司。

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