軍團(tuán)菌的取樣、制樣與檢測(cè)方法！
軍團(tuán)菌的取樣、制樣與檢測(cè)方法！
本標(biāo)準(zhǔn)描述了一種用于軍團(tuán)菌分離和估計(jì)環(huán)境樣品中軍團(tuán)菌數(shù)量的培養(yǎng)方法。
該方法適用于所有環(huán)境樣本，包括飲用水、工業(yè)用水和天然水以及沉淀物、沉積物和粘土/軟泥等相關(guān)樣本。
一、培養(yǎng)基和試劑
GVPC培養(yǎng)基、BCYE培養(yǎng)基(也可用硝酸鐵瓊脂代替)、酸處理緩沖液、BCYE-Cys(不含L-半*)
二、取樣
1、取樣容器
水樣可采用玻璃、聚乙烯或類(lèi)似容器。以前用過(guò)的容器應(yīng)該清洗干凈、扣干水分，121℃高壓滅菌15min。如果容器不能經(jīng)受高壓滅菌，應(yīng)在高于70℃的流動(dòng)熱水或流動(dòng)蒸汽中處理至少5min。
2、含生物防腐劑的樣品
如果水樣中含有或被認(rèn)為含有氧化型生物防腐劑，應(yīng)在取樣時(shí)或取樣前加入非活性試劑加以中和。如果水樣中含有消毒劑，需在采樣前或采樣后加入中和劑，含氯或氧化型消毒劑可用*或硫代硫酸鉀作中和劑。
原則上講，實(shí)驗(yàn)室接到水樣后應(yīng)盡快進(jìn)行微生物學(xué)分析，是取樣當(dāng)天，尤其對(duì)于已知含生物防腐劑的樣品。因此，建議從樣品采集到制備好濃縮樣的間隔為2d，不應(yīng)超過(guò)5d，長(zhǎng)不超過(guò)14d。
3、樣品運(yùn)輸
樣品應(yīng)在6-18℃條件下被運(yùn)輸，應(yīng)避免熱和光照，在1d內(nèi)，不超過(guò)2d將樣品送到實(shí)驗(yàn)室。
三、制樣
如果液體樣品軍團(tuán)菌的數(shù)量估計(jì)超過(guò)105CFU/L，可以采用直接平板法，即直接涂布于GVPC平板。為了確保低于這個(gè)數(shù)量樣品中軍團(tuán)菌的檢測(cè)，需采用濃縮技術(shù)。為了濃縮水樣，可采用膜過(guò)濾法或離心法。
1、膜過(guò)濾法
如果樣品是渾濁的、乳濁的或有顏色的，應(yīng)采用離心法。
采用膜過(guò)濾裝置進(jìn)行膜過(guò)濾，采用直徑47-147mm，孔徑0.22μm和0.45μm的膜。過(guò)濾后的膜應(yīng)放置在帶蓋的無(wú)菌容器中，可用無(wú)菌剪刀剪碎，加5ml-25ml的無(wú)菌稀釋液或無(wú)菌去離子水，不斷搖動(dòng)至少2min。也可將容器放入超聲波中2-10min。
2、離心法
取200ml樣品于300-500ml容積的離心瓶中，6000g離心10min或3000g離心30min，保持溫度在15-25℃，棄去上清液，將沉淀物懸浮在2-20ml無(wú)菌稀釋液或無(wú)菌去離子水中。
四、培養(yǎng)
1、將制備好的樣品（濃縮的或未濃縮的）
分成3份，1份不做任何處理；1份進(jìn)行熱處理；1份進(jìn)行酸處理。
2、熱處理
加1±0.5ml樣品于一無(wú)菌容器中，50±1℃水浴處理30±2min。
3、酸處理
加1-10ml樣品于一擰蓋的容器中，6000g離心10min或3000g離心30min，用無(wú)菌槍頭吸去一半體積的上清液，通過(guò)渦旋重新懸浮剩余物，用酸處理緩沖液補(bǔ)足原始體積?；旌响o置5±0.5min。
4、選擇性培養(yǎng)基的接種
分別接種未處理、熱處理和酸處理的樣品0.1-0.5ml于GVPC培養(yǎng)基上，熱處理和酸處理的樣品應(yīng)在處理完立即接種，記錄接種體積。
5、培養(yǎng)
翻轉(zhuǎn)平板，36±1℃培養(yǎng)10d。
6、檢查平板
在10d的培養(yǎng)期間，用顯微鏡在2-4d內(nèi)至少觀察3次，軍團(tuán)菌生長(zhǎng)較慢，很可能被其他菌掩蓋，記錄每一種菌落形態(tài)的數(shù)量。
注：軍團(tuán)菌的菌落通常是白-灰-藍(lán)-紫，但也可能出現(xiàn)棕色、粉色、灰綠色或深紅色。軍團(tuán)菌表面光滑，邊緣整齊，出現(xiàn)典型的毛玻璃現(xiàn)象。在紫外光下， L.bozemanii, L.gormanii, L.dumoffii, L.anisa, L.cherrii, L.steigerwaltii, L.gratiana, L.tucsonensis和L.parisiensis有亮白色熒光；L.rubrilucens 和L.erythra呈現(xiàn)紅色；L.pneumophila菌落呈現(xiàn)暗綠色通常伴隨有黃色。熒光的顏色有助于區(qū)分樣品中軍團(tuán)菌的不同種。為了避免軍團(tuán)菌的死亡，不能將平板長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈下。
五、可疑軍團(tuán)菌的確證
1、BCYE和其他培養(yǎng)基的二次培養(yǎng)
從每個(gè)GVPC平板上至少選擇3個(gè)可疑軍團(tuán)菌菌落接種到BCYE和BCYE-Cys兩塊平板上進(jìn)行二次培養(yǎng)，36±1℃培養(yǎng)至少2d。在BCYE上生長(zhǎng)而在BCYE-Cys上不生長(zhǎng)的被認(rèn)為是軍團(tuán)菌。通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)（6.2）確證在BCYE上生長(zhǎng)而在BCYE-Cys上不生長(zhǎng)的菌落。
2、PCR及其相關(guān)技術(shù)：優(yōu)點(diǎn)：有著更高的靈敏度和特異性，缺點(diǎn)：非特異性擴(kuò)增 及交叉污染。
3、直接免疫熒光抗體法（DFA）：優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，缺點(diǎn)是敏感性低，且只能用于Lp的檢測(cè)。
注：血瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂可以代替BCYE-Cys培養(yǎng)基。
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