微生物基因組技術(shù)的菌種選育新方法！

微生物基因組技術(shù)的菌種選育新方法！

⒈嗜酸氧化亞鐵硫桿菌及其活性的基因芯片撿測(cè)方法

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，以下簡(jiǎn)稱A.f菌)，是生物冶金中的菌種，同時(shí)也是研究多的浸礦微生物。利用A.f標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 23270全基因組3217個(gè)基因序列信息，構(gòu)建A.f標(biāo)準(zhǔn)菌株全基因組基因芯片有研究報(bào)道。通過(guò)對(duì)我國(guó)各個(gè)不同礦區(qū)的硫化礦進(jìn)行播瓶試驗(yàn)、柱浸試驗(yàn)和堆浸試驗(yàn)，篩選得到各種不同氧化活性類型的A.f菌。同時(shí)對(duì)樣品菌株和模式菌株進(jìn)行基因組DNA和RNA的提取與純化并進(jìn)行熒光標(biāo)記；取標(biāo)記量相等的樣品熒光標(biāo)記產(chǎn)物和模式菌熒光標(biāo)記產(chǎn)物混合后，與所構(gòu)建的A.f標(biāo)準(zhǔn)菌株全基因組基因芯片雜交12-18h；雜交后的芯片應(yīng)用激光共聚掃描儀，在分辨率1Oμm下進(jìn)行掃描。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)分析，在3217個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)有967個(gè)基因?yàn)椴煌木晁?，其余的2250個(gè)基因?yàn)樗蠥.f菌共有；另發(fā)現(xiàn)320個(gè)高氧化活性菌特征基因，據(jù)此建立了“嗜酸氧化亞鐵硫桿菌及其活性的基因芯片檢測(cè)方法”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 20929-2007)，并從廣西大廠、云南東川、思茅、廣東大寶山、梅州、湖北大冶、江西德興、甘肅白銀、湖南瀏陽(yáng)七寶山等20多個(gè)典型礦區(qū)的酸性礦坑水、積液池或浸礦堆采樣120份，誦討上述分析從樣品中檢測(cè)出5株高活性A.f菌株，經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)性狀、形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列等分析，鑒定該菌株為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌。進(jìn)一步的現(xiàn)場(chǎng)浸礦試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌浸礦75天后，其浸出率達(dá)到65.25%，標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 23270為37.54%，另一株低活性菌僅為24.86%。

⒉菌群快速檢測(cè)的浸礦微生物群落基因組芯片

將分離培養(yǎng)所獲得的純菌基因組DNA直接點(diǎn)樣于芯片片基上，制備出了浸礦微生物群落基因組芯片。該群落基因組芯片含有5個(gè)屬、15個(gè)種、50多個(gè)菌株。研究結(jié)果表明，在55℃、50%甲酰胺的雜交條件下，該芯片具有種間特異性，其靈敏度達(dá)到0.lng基因組DNA,并具有較好的定量性能該芯片可以同時(shí)檢測(cè)浸礦環(huán)境中多種微生物，利用這些信息為浸礦菌種的選育提供了基因指導(dǎo)。

⒊菌群結(jié)構(gòu)與功能快速分析的浸礦微生物功能基因芯片

所謂功能基因芯片，是以與生理活動(dòng)相關(guān)的功能基因作探針?biāo)鶚?gòu)建的基因芯片。目前構(gòu)建的針對(duì)浸礦微生物群落結(jié)構(gòu)與功能分析的功能基因芯片，探針除含有功能基因外，還含有能反映微生物系統(tǒng)發(fā)育和分類地位的浸礦微生物165 rRNA基因。其中，從38種微生物和518個(gè)克隆中獲得825個(gè)與浸礦過(guò)程相關(guān)的功能基因序列629條，并設(shè)計(jì)出603個(gè)探針，從與浸礦體系相關(guān)的微生物及克隆子中獲得16S rRNA基因序列2003條，并設(shè)計(jì)出探針600條。該芯片能夠結(jié)合浸礦微生物16S rRNA和功能基因，能夠同時(shí)分析環(huán)境中有哪些微生物存在及這些微生物可能發(fā)揮的作用，從而利用這些信息有目的地篩選特定功能的浸礦微生物。

⒋菌群代謝分析的浸礦微生物宏基因組芯片

X.Guo等人利用德興銅礦浸礦體系中提取得到的環(huán)境總DNA構(gòu)建了一個(gè)宏基因組文庫(kù)，該宏基因組文庫(kù)中共包含7776個(gè)含有30～50kb大插入片段的克隆子。同時(shí)，為了從文庫(kù)中快速篩選含有目的基因的克隆子，利用該文庫(kù)構(gòu)建了一種宏基因組芯片。另一方面，研究者也通過(guò)芯片雜交從宏基因組文庫(kù)中篩選得到了一個(gè)新穎的固氮基因簇。通過(guò)進(jìn)一步分析表明，該基因簇*不同于已知的任何一種固氮微生物中的基因簇，該基因簇很可能來(lái)自一種未知的酸性微生物中。在這些研究的過(guò)程中，對(duì)浸礦體系中的微生物群落遺傳和代謝過(guò)程有了更加深人的認(rèn)識(shí)，為開(kāi)展進(jìn)一步的研究提供了很好的基礎(chǔ)。這項(xiàng)研究表明，宏基因組芯片作為一種高通量的基因組的工具來(lái)研究微生物群落的代謝多樣性具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，這對(duì)篩選高效菌株具有重要意義。

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