功能
• 二硫鍵還原反應(yīng)器
• HDX反應(yīng)器
隨著生物制藥產(chǎn)品在市場(chǎng)上的快速增長(zhǎng),對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中更快速、更有效的結(jié)構(gòu)闡明方法的需求越來(lái)越大。在這個(gè)工作流程中有一個(gè)小而關(guān)鍵的步驟,那就是二硫鍵的還原。傳統(tǒng)的方法是使用化學(xué)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。Antec開(kāi)發(fā)了用于自動(dòng)在線二硫化物鍵還原的ROXY反應(yīng)器。
該方法是基于一個(gè)電勢(shì)來(lái)觸發(fā)還原反應(yīng),不使用還原性化學(xué)品。傳統(tǒng)上,還原是使用化學(xué)品進(jìn)行的,例如二硫蘇糖醇(DTT),需要在LC/MS分析之前去除。此外,也可以使用無(wú)硫醇還原劑,如TCEP(三(2-羧乙基)膦)?;瘜W(xué)法樣品制備是費(fèi)力的,很難與在線LC/MS相結(jié)合。用質(zhì)譜在線設(shè)置的電化學(xué)是干凈的,不需要化學(xué)品,結(jié)果可以即時(shí)監(jiān)測(cè)。
圖1:ROXY EC系統(tǒng)配備了µ- prepcell2.0流通池,并與布魯克SolariX 12T FT-ICR質(zhì)量聯(lián)用,進(jìn)行準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)MS和MS/MS分析
二硫鍵對(duì)HDX-MS來(lái)說(shuō)是一個(gè)挑戰(zhàn),因?yàn)樗鼈冊(cè)黾恿说鞍踪|(zhì)對(duì)酶解的穩(wěn)定性,這可能導(dǎo)致低序列覆蓋,特別是在富含半的區(qū)域。
因?yàn)镠DX淬火條件(0°C和pH2.5)下的還原速度較慢, 傳統(tǒng)上使用的化學(xué)還原劑(如TCEP)通常不能處理高二硫鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)。此外,這些藥劑通常需要在高濃度下使用,這可能導(dǎo)致廣泛的加合物形成和離子抑制.
在HDX兼容的條件下,電化學(xué)還原已經(jīng)成功地用于還原重二硫鍵結(jié)合的蛋白,使序列覆蓋其他難以達(dá)到的區(qū)域,并繞過(guò)不利的離子抑制ROXY HDX反應(yīng)提供了高還原效率,改進(jìn)的可重復(fù)性和穩(wěn)健性,沒(méi)有不必要的蛋白質(zhì)氧化。
圖2:Waters HDX-MS (Synapt G2Si)系統(tǒng)與ROXY聯(lián)用的示意圖,電化學(xué)流通池可以在0°C(1)下放置在HDX管理器內(nèi)或在室溫(2)下放置在室外。