【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】在生物學(xué)研究的前沿，對(duì)活體組織中復(fù)雜三維亞細(xì)胞動(dòng)態(tài)的非侵入性解析需求日益增長(zhǎng)。為了實(shí)現(xiàn)空間分辨率、成像深度、光毒性三者的同時(shí)優(yōu)化，北京大學(xué)席鵬教授團(tuán)隊(duì)將共聚焦掃描成像與結(jié)構(gòu)光超分辨巧妙結(jié)合起來，提出一種多點(diǎn)晶格共聚焦圖像掃描顯微解決方案，通過優(yōu)化針孔直徑和間距、消除離焦信號(hào)和引入減幀重建算法來克服現(xiàn)有技術(shù)在時(shí)空分辨率平衡方面的局限性，極大地?cái)U(kuò)展了超分辨率成像在生物體內(nèi)的應(yīng)用范圍。
 

　　隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，在組織層面揭示其內(nèi)部三維精細(xì)結(jié)構(gòu)、捕捉快速生物動(dòng)態(tài)過程等成像需求日益增加。共聚焦激光掃描顯微技術(shù)因其卓越的光學(xué)切片能力和多功能性，在散射組織的深度成像中一直被視為首選。然而，縮小針孔尺寸以提升分辨率會(huì)導(dǎo)致信號(hào)下降，限制成像質(zhì)量。圖像掃描顯微技術(shù)(Image Scanning Microscopy，ISM)通過將單點(diǎn)探測(cè)器替換為探測(cè)器陣列，基于像素重定位和解卷積算法，在保持共聚焦層切能力的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了相比于衍射極限兩倍的分辨率提升。相比于其他超分辨顯微技術(shù)，ISM更能抵抗深度成像時(shí)所引起的像差和散射等問題。
 

　　席鵬團(tuán)隊(duì)提出多點(diǎn)共聚焦多點(diǎn)共聚焦圖像掃描顯微(Multi-confocal Image Scanning Microscopy，MC-ISM)技術(shù)，通過晶格針孔陣列產(chǎn)生多焦點(diǎn)照明，相比于傳統(tǒng)ISM利用單點(diǎn)進(jìn)行掃描，這種并行化的配置配合類似阿基米德螺線的單振鏡掃描，極大提高了全視場(chǎng)成像速度。通過優(yōu)化針孔直徑和間距、應(yīng)用光學(xué)鎖相探測(cè)(OLID)處理抑制離焦信號(hào)，提高成像質(zhì)量?；谙袼刂囟ㄎ缓瓦M(jìn)一步的解卷積后處理，MC-ISM可實(shí)現(xiàn)2倍的三維分辨率提升。此外，通過引入多圖反卷積重建算法進(jìn)行減幀重建，MC-ISM可進(jìn)一步提高成像速度，比多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡提高了16倍。
 

圖1. MC-ISM光路圖以及像素重分配和減幀重建結(jié)果
 

　　研究團(tuán)隊(duì)利用MC-ISM技術(shù)對(duì)小鼠腎切片進(jìn)行了三色3D超分辨成像，在66.5μm×66.5μm×12μm的體積內(nèi)，以150nm的軸向間隔實(shí)現(xiàn)了絲狀肌動(dòng)蛋白、腎單位成分及核結(jié)構(gòu)的清晰分離，橫向與軸向分辨率分別提升至131nm和336nm。MC-ISM有效抑制了離焦信號(hào)，展現(xiàn)出與轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡相當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)切片能力。此外，使用20倍長(zhǎng)工作距離物鏡，MC-ISM對(duì)DAPI染色的斑馬魚頭部進(jìn)行深層成像，同樣展現(xiàn)出卓越的性能，在整個(gè)成像體積內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見。相較于寬場(chǎng)和共聚焦模態(tài)，分辨率顯著提升。
 

圖2. MC-ISM小鼠腎切片組織樣本和斑馬魚成像結(jié)果
 

　　MC-ISM因其簡(jiǎn)化的探測(cè)光路而展現(xiàn)出增強(qiáng)的光子收集效率。在相同信噪比條件下，MC-ISM在1000幀成像后的熒光強(qiáng)度下降至67%，表明其光漂白程度低于OMX結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡、超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡和Airyscan超分辨顯微鏡。此外，MC-ISM以7.5幀每秒的速度對(duì)U2OS細(xì)胞中的線粒體進(jìn)行成像，過程中線粒體未發(fā)生腫脹現(xiàn)象，表現(xiàn)出成像系統(tǒng)極低的光毒性。在植物細(xì)胞中，MC-ISM成功克服了組織散射和自發(fā)熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)擬南芥下胚軸內(nèi)線粒體的原位超分辨成像，展示了其在厚植物組織中超分辨成像的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。這些結(jié)果證明了MC-ISM系統(tǒng)在研究線粒體動(dòng)態(tài)方面的優(yōu)越性和廣泛應(yīng)用潛力。
 

圖3. MC-ISM動(dòng)物細(xì)胞線粒體和擬南芥下胚軸植物組織線粒體動(dòng)態(tài)成像結(jié)果
 

　　破衍射極限現(xiàn)細(xì)胞真顏，執(zhí)細(xì)膩筆觸繪生命畫卷。憑借專門的硬件設(shè)計(jì)與先進(jìn)算法的完美協(xié)同，MC-ISM深入樣本內(nèi)部，精細(xì)觀察組織深層結(jié)構(gòu)，以高速度捕捉瞬息萬變的生命體動(dòng)態(tài)。其較低的光毒性使細(xì)胞得以自然地展現(xiàn)其生命力，從而揭示了生物體內(nèi)復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的奧秘。MC-ISM與現(xiàn)有共聚焦系統(tǒng)的高度兼容性，加之其成本效益和操作簡(jiǎn)便性，使其成為引領(lǐng)下一代共聚焦顯微技術(shù)的強(qiáng)有力競(jìng)爭(zhēng)者。
 

　　該成果以“Expanding super-resolution imaging versatility in organisms with multi-confocal image scanning microscopy”為題發(fā)表于National Science Review(IF：16.3)。北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院博士生任偉、關(guān)美玲(現(xiàn)為中國(guó)科學(xué)院空天院博士后)和梁謙禧為共同第一作者。席鵬、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李美琪為本文的共同通訊作者。論文主要貢獻(xiàn)者還包括北京大學(xué)蘇都莫日根教授，金博雅博士，博士生段光興、張麗雅、侯宜偉，河北大學(xué)高保祥教授和研究生蓋希川。本工作得到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金的支持，也得到北京艾銳精儀科技有限公司、北京大學(xué)國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心和光飛納科技公司的幫助。