逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) ( (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。

反應(yīng)注意事項：

1．在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。

2．為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照。

3．內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4． PCR不能進(jìn)入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實驗來確定。

5．防止DNA的污染：

① 采用DNA酶處理RNA樣品；

② 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。