Wnt加工和分泌抑制劑(IWP-2)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號	FS-X10629

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：Wnt加工和分泌抑制劑(IWP-2)

英文名稱：IWP-2

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|10mg|50mg

貨號：FS-X10629

產(chǎn)品介紹:

IWP-2抑制Wnt加工和分泌，IC50為27nM。

注：本品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號：686770-61-6

純度：97.40%

分子量：466.6

儲存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請盡量在一個(gè)月內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

構(gòu)巢曲霉Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗人IgMAnti-SRCIN1 Antibody高爾基蛋白73(GP73)

草木樨中華根瘤菌Alexa Fluor 555標(biāo)記的羊抗人IgMAnti-SRI Antibody干因子(SCF)

雅致小克銀漢霉Alexa Fluor 647標(biāo)記的羊抗人IgMAnti-SRI Antibody干擾誘導(dǎo)T-α亞族趨化劑(ITαC)

分枝卷霉PE-Cy5.5標(biāo)記的羊抗人IgMAnti-SRP1/KPNA1 Antibody干擾調(diào)節(jié)因子9(IRF9)

大腸埃希氏桿菌PE-Cy7標(biāo)記的羊抗人IgMAnti-SRSF3 Antibody干擾調(diào)節(jié)因子5(IRF5)

釀酒酵母Cy3標(biāo)記的羊抗人IgMAnti-SSR3 Antibody干擾調(diào)節(jié)因子4(IRF4)

灰樹花堿性磷（AP）標(biāo)記的羊抗人IgMAnti-SRY Antibody干擾調(diào)節(jié)因子1(IRF1)

東方伊薩酵母辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗人IgMAnti-SSTR2 Antibody干擾ω(IFNω)

短柄帚霉辣根過氧化物標(biāo)記的小鼠抗人IgGAnti-SRSF1 Antibody(PB0431)干擾κ(IFNκ)

薄蓋靈芝堿性磷（AP）標(biāo)記的小鼠抗人IgGAnti-SSTR3 Antibody干擾ε(IFNε)

曲霉羅丹明標(biāo)記的小鼠抗人IgGAnti-SSX2 Antibody干擾γ誘導(dǎo)蛋白30(IFI30)

殼梭孢屬（都不提供）FITC標(biāo)記的小鼠抗人IgGAnti-SSTR1 Antibody干擾γ誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)

枯草芽孢桿菌膠體金標(biāo)記的小鼠抗人IgGAnti-ST13 Antibody干擾γ誘導(dǎo)單核因子(MIγ)

鉛黃腸球菌PE-Cy5.5標(biāo)記的小鼠抗人IgGAnti-ST13 Antibody干擾γ(IFNγ)

粉紫小菇PE-Cy7標(biāo)記的小鼠抗人IgGAnti-ST7 Antibody干擾β(IFNβ)

假絲酵母屬Alexa Fluor 350標(biāo)記的小鼠抗人IgGAnti-STAR Antibody干擾α8(IFNα8)

谷受體調(diào)節(jié)蛋白2抗體檸檬明串珠菌大鼠成年表皮角質(zhì)形成層細(xì)胞提取物

鈉鈣交換蛋白3抗體蒼白桿菌屬大鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞提取物

NDUFAF4抗體鞘桿菌屬宮頸上皮細(xì)胞和腫瘤原代細(xì)胞提取物

巰基氧化1抗體羅輪隱球酵母直腸上皮細(xì)胞和腫瘤原代細(xì)胞提取物
Wnt加工和分泌抑制劑(IWP-2)河北木霉 (R)-5,5-聯(lián)苯-2-甲基-3,4--1,3,2-惡唑烷球蛋白G2

四繞曲霉 (S)-(-)-2-甲基-CBS-噁唑烷球蛋白G2a

釀酒酵母煙嘧磺隆球蛋白M

植物乳桿戊二二甲酯內(nèi)皮型一氧化氮合

損蘑菇紫色桿二乙二乙皮質(zhì)

斜臥青霉二乙二乙羥甲基戊二單酰還原

靈芝(紅芝, 赤芝) 丁基三化錫羥脯

水原市土地桿 (R)-3,3'-二溴-1,1'-聯(lián)-2-萘熱休克蛋白-70

乳桿屬 10-十一烯甲酯乳糖

嗜中溫寒冷桿 (R)-3,3'-二溴-1,1'-聯(lián)-2-萘狀腺原

耐輻射奇球 1,2-辛二神經(jīng)型一氧化氮合成

小海綿羊肚苯磺氨地平生長

漢遜德巴利酵母鎢生長結(jié)合蛋白

大腸埃希氏 1-(2-苯甲)哌瘦

短波單胞屬 1,3-單乙胎盤生長因子
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)