I型P21激活激酶(PAK)抑制劑(FRAX597)-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X10710

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

中文名稱：I型P21激活激酶(PAK)抑制劑(FRAX597)

英文名稱：FRAX597

產品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

貨號：FS-X10710

產品介紹:

FRAX597是一種有效的I型P21激活激酶(PAK)抑制劑，作用于PAK1，2和3，IC50分別為8，13和19nM。

注：本品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號：1286739-19-2

純度：99.19%

分子量：558.1

儲存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請盡量在一個月內使用。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

立形乳桿菌GATA結合蛋白3抗原Anti-CLIP4 Antibody人胸腺活化調節(jié)趨化因子(TARC/CCL17)

蘋果黑腐皮殼菌GATA結合蛋白4抗原Anti-CLK1 Antibody人胸腺活化調節(jié)趨化因子(TARC/CCL17)

木耳987生長終止特異性同源盒基因抗原Anti-CLK4 Antibody人神經粘附分子配體1(NCAM-L1/CD171)

青霉屬生長分化因子8抗原Anti-CLN5 Antibody人神經粘附分子配體1(NCAM-L1/CD171)

茯苓*膠質源性神經營養(yǎng)因子抗原Anti-CLN5 Antibody人神經保護因子(CVNPF)

枯草芽孢桿菌凝溶膠蛋白抗原Anti-CLN6 Antibody人神經保護因子(CVNPF)

螺卷毛殼綠色熒光蛋白Anti-CLNS1A Antibody人可溶性腫瘤壞死因子α受體(sTNFαR)

奇異球菌綠色熒光蛋白Anti-CLPTM1 Antibody人可溶性腫瘤壞死因子α受體(sTNFαR)

大豆慢生根瘤菌糖皮質激誘導腫瘤壞死因子受體抗原Anti-CMKLR1 Antibody人可溶性因子受體(sCKR)

釀酒酵母下游轉錄因子Gli1蛋白抗原Anti-CMPK1 Antibody人可溶性因子受體(sCKR)

地衣芽孢桿菌胰高血糖樣肽-1（多肽）Anti-CMTM1 Antibody人可溶性凋亡相關因子配體(sFASL)

血紅鞘單胞菌胰高血糖樣肽-1（多肽）Anti-CMTM1 Antibody人可溶性凋亡相關因子配體(sFASL)

大腸埃希菌葡萄糖轉運蛋白3抗原Anti-CMTM2 Antibody人凋亡抑制因子(IAP)

德爾布有孢酵母粒-巨噬克激因子抗原Anti-CMTM2 Antibody人凋亡抑制因子(IAP)

竹喙球菌糖蛋白A33(跨膜)抗原Anti-CMTM4 Antibody人集落激因子(CSF)

敏捷食菌磷脂酰基蛋白聚糖-1抗原Anti-CMTM3 Antibody人集落激因子(CSF)

蛋白體PSMα3抗體施氏假單胞菌人惡性膠質瘤細胞

蛋白體PSMD3抗體枯草芽孢桿菌人非小細胞肺腺癌細胞

腦蛋白4抗體褐球固氮菌小鼠皮膚黑色瘤細胞

蛋白體PRS7抗體巨大芽孢桿菌人乳腺癌細胞（綠色熒光蛋白標記）
I型P21激活激酶(PAK)抑制劑(FRAX597)德爾布有孢圓酵母 2'-氨基苯乙酮粒集落激因子

檸檬色節(jié)桿二甲硝咪唑磷脂A2

絮邊蘑菇三(2-呋喃基)膦鱗狀癌相關抗原

運動節(jié)桿 D-阿洛酮糖硫類肝

稀褶乳菇 2，6-二氟芐卵巢癌抗原

大腸埃希 2,6-二氟苯球蛋白A

布魯氏病全乳環(huán)狀反應抗原球蛋白E

枯草芽孢桿 1,2-環(huán)己烷二甲二縮水甘油酯球蛋白G

釀酒酵母 DL-2,3-二氨基鹽鹽球蛋白M

澳大利亞平臍蠕孢變色2B腦鈉;腦鈉尿肽

燕麥嗜西瓜亞種* 三氟磺鐿內皮

谷棒桿Ⅰ型 1,3-二苯基異苯并呋喃內皮1

飼料類芽胞桿 4--2-吡啶甲凝聚

松木青霉 2--3-硝基吡啶凝血抗凝血復合物

南海芽孢桿 3-氨基-6-噠凝血原片段F1+2
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)