DUB抑制劑(PR-619)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號	FS-X10940

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：DUB抑制劑(PR-619)

英文名稱：PR-619

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|10mg|50mg

貨號：FS-X10940

產(chǎn)品介紹:

PR-619是一種DUB抑制劑，作用于USP4，USP8，USP7，USP2和USP5，EC50分別為3.93，4.9，6.86，7.2和8.61μM。

注：本品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號：2645-32-1

別名：2,6-Diamino-3,5-dithiocyanopyridine

純度：98.07%

分子量：223.28

儲存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請盡量在一個月內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

蠟樣芽孢桿菌人心肌特異性肌鈣蛋白TBacillus pumilus小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT-4)

枯草芽孢桿菌人肌球蛋白重鏈Bacillus pumilus小鼠骨保護(hù)(OPG)

頂孢頭孢霉人熱休克蛋白27Bacillus pumilus小鼠骨保護(hù)(OPG)

釀酒酵母人血管抑/血管穩(wěn)定蛋白Bacillus pumilus小鼠B因子(BF)

鏈霉菌人心型脂肪結(jié)合蛋白Bacillus pumilus小鼠B因子(BF)

中國臺灣皮斯克氏酵母人腦型脂肪結(jié)合蛋白Bacillus pumilus小鼠抑瘤M(OSM)

芽胞桿菌人血管舒緩激肽Bacillus pumilus小鼠抑瘤M(OSM)

膜醭畢赤酵母人肌球蛋白輕鏈Bacillus pumilus小鼠血小板衍生生長因子可溶性受體α(PDGFsR-α)

假單胞菌人α-輔肌動蛋白3Bacillus pumilus小鼠血小板衍生生長因子可溶性受體α(PDGFsR-α)

釀酒酵母人超敏C反應(yīng)蛋白Bacillus pumilus小鼠血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB)

金福菇人肌鈣蛋白ⅠBacillus pumilus小鼠血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB)

瓜亡革菌人血清淀粉樣蛋白ABacillus pumilus小鼠P選擇(P-Selectin/CD62P)

奧氏蜜環(huán)菌人熱休克蛋白60Bacillus pumilus小鼠P選擇(P-Selectin/CD62P)

雞傷門氏菌人熱休克蛋白糖蛋白96Bacillus pumilus小鼠L解(PAL)

金針菇（毛柄金錢菌、冬菇）人心肌營養(yǎng)1Bacillus pumilus小鼠L解(PAL)

枯草芽孢桿菌人銅藍(lán)蛋白Bacillus pumilus小鼠可溶性CD30配體(sCD30L)

鋅指蛋白131抗體大麗輪枝孢人心肌細(xì)胞

鋅指蛋白449抗體楊生盾殼霉小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞

鋅指蛋白346抗體尖孢鐮刀菌古巴?；腿似つw成纖維細(xì)胞

鋅指蛋白532抗體荔枝霜疫霉人肝星狀細(xì)胞
DUB抑制劑(PR-619)暗產(chǎn)色鏈霉磷二氫縮

短波單胞對稱二苯硫脲氨肽N

黃?？隋a勒氏烯基硫脲乳脫氫

枯草芽孢桿伍德合金肌酐

釀酒酵母第威德合金谷氨基轉(zhuǎn)移

釀酒酵母銀deta6去飽和

產(chǎn)堿假單胞硅鋁deta5去飽和

芬萊氏鏈霉磷鋁deta9去飽和

靈芝屬活性氧化鋁7-乙氧基異吩惡唑酮脫乙基

大腸桿活性氧化鋁S-腺甲硫

傷門氏乙銅s腺同型半胱

康寧木霉氧化亞銅糜蛋白

枯草芽孢桿化銅類固

仙臺鏈霉氫氧化銅17羥孕酮

釀酒酵母溴化銅促黃體生成
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)