MLKL藥理抑制劑(Necrosulfonamide)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X10609

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱(chēng)：MLKL藥理抑制劑(Necrosulfonamide)

英文名稱(chēng)：Necrosulfonamide

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg

貨號(hào)：FS-X10609

產(chǎn)品介紹:

Necrosulfonamide是一個(gè)MLKL藥理抑制劑，在HT-29細(xì)胞的IC50是124nM.

注：本品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號(hào)：1360614-48-7

純度：98.00%

分子量：461.47

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請(qǐng)盡量在一個(gè)月內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

哈茨木霉Alexa Fluor 647標(biāo)記的羊抗雞IgGAnti-RXRA Antibody肌肌激(CKM)

亮白曲霉Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗雞IgGAnti-S100A10 Antibody肌紅蛋白(MYO)

伯克霍爾德菌*FITC標(biāo)記的兔抗雞IgGAnti-S100A11 Antibody肌三磷(ITPA)

枯草芽胞桿菌辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的兔抗雞IgGAnti-S100A4 Antibody肌鈣腔蛋白(SRL)

松口蘑Alexa Fluor 350標(biāo)記的兔抗雞IgGAnti-S100A6 Antibody肌鈣蛋白T()

普通變形桿菌*Alexa Fluor 488標(biāo)記的兔抗雞IgGAnti-S100A6 Antibody肌鈣蛋白I(TNI)

中間氣單胞菌辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的驢抗兔IgGAnti-S100A7 Antibody肌動(dòng)絲蛋白(AF)

地衣芽胞桿菌FITC標(biāo)記的驢抗兔IgGAnti-S100A6 Antibody肌動(dòng)蛋白束蛋白3(FSCN3)

巴氏醋桿菌堿性磷（AP）標(biāo)記的驢抗兔IgGAnti-SACS Antibody肌動(dòng)蛋白束蛋白2(FSCN2)

冰川薄層菌屬Cy5標(biāo)記的驢抗兔IgGAnti-S100A9 Antibody肌動(dòng)蛋白束蛋白(FSCN)

釀酒酵母Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgGAnti-S100A8 Antibody肌動(dòng)蛋白γ1(ACTγ1)

總狀毛霉Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗兔IgGAnti-S100B Antibody肌動(dòng)蛋白β(ACTβ)

枯草芽孢桿菌Alexa Fluor 647標(biāo)記的驢抗兔IgGAnti-S100A9 Antibody肌蛋白(MSC)

圍小叢殼菌PE標(biāo)記的兔抗狗IgGAnti-SAFB Antibody肌加氧(MIOX)

哈茨木霉生物標(biāo)記的驢抗兔IgGAnti-SAMHD1 Antibody肌單磷3(IMPA3)

扇形側(cè)耳生物標(biāo)記的羊抗兔IgGAnti-SAG Antibody肌單磷2(IMPA2)

間變性淋巴瘤激核相互作用伴侶蛋白抗體甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌大鼠小腸平滑肌細(xì)胞提取物

核仁蛋白C23抗體疣孢漆斑菌大鼠直腸平滑肌細(xì)胞提取物

神經(jīng)細(xì)胞穿透2抗體枯草芽胞桿菌大鼠腸上皮細(xì)胞提取物

A型流感核蛋白抗體禾谷鐮孢大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞提取物
MLKL藥理抑制劑(Necrosulfonamide)非洲黑蛋巢 2,3-二氟-4-羥基苯糖皮質(zhì)

花臉香蘑 BAPTA-AM鹽皮質(zhì)

Rhodoligotrophos 三(羥甲基)硝烷甘膽抗體

大腸埃希氏灰黃霉絨毛膜促性腺抗體

紫云英根瘤* 三(五氟苯基)膦雌二

大鎖銀耳 O-(5-降烯基-2,3-二羰亞)-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟黃體生成

球形節(jié)桿 O-(2-氧代-1(2H)吡啶基)-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟鹽促卵泡

雙孢蘑菇(白蘑菇、洋蘑菇) N,N,N',N'-四甲基-O-(3,4-二氫-4-氧代-1,2,3-苯并三-3-基)脲四氟鹽促性腺釋放

釀酒酵母 1-丁基-3-甲基化吡啶鎓催乳

白靈側(cè)耳（白靈菇） 3-二甲氨基苯鹽鹽胰島樣生長(zhǎng)因子1

串珠鐮孢* 對(duì)二甲藍(lán)麻疹病

布蘭克假絲酵母對(duì)二甲藍(lán)傳染性貧血

平常假絲酵母 (S)-4-(Boc-氨基)-2-(Fmoc-氨基)丁傳染性腦脊髓炎

單生雞腿10 Fmoc-D-Ala-OPfp傳染性胸膜肺炎

帶小棒鏈霉 4-羥基-3-(三氟甲基)苯乙型腦炎病
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)