自噬激酶ULK1抑制劑(SBI-0206965)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X10777

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：自噬激酶ULK1抑制劑(SBI-0206965)

英文名稱：SBI-0206965

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

貨號(hào)：FS-X10777

產(chǎn)品介紹:

SBI-0206965是一種強(qiáng)效,選擇性和細(xì)胞滲透性自噬激酶ULK1抑制劑,抑制ULK1和ULK2激酶活性,IC50值分別為108nM和711nM。

注：本品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號(hào)：1884220-36-3

純度：98.04%

分子量：489.32

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請(qǐng)盡量在一個(gè)月內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

大腸埃希氏菌羅丹明標(biāo)記兔抗FITCAnti-KCNK7 Antibody人旋毛蟲(chóng)抗體(Trichinella Ab)

紫云英根瘤菌*羅丹明標(biāo)記羊抗人IgAAnti-KCNK9 Antibody人旋毛蟲(chóng)抗體(Trichinella Ab)

大鎖銀耳羅丹明標(biāo)記親合Anti-KCNMB2 Antibody人破傷風(fēng)抗體(Tetanus Ab)

球形節(jié)桿菌羅丹明標(biāo)記蛋白AAnti-KCNMB2 Antibody人破傷風(fēng)抗體(Tetanus Ab)

雙孢蘑菇(白蘑菇、洋蘑菇)羅丹明標(biāo)記牛IgGAnti-KCNMB4 Antibody人鉤端螺旋體IgM(Lebtospira)

釀酒酵母羅丹明標(biāo)記牛IgMAnti-KCNN3 Antibody人鉤端螺旋體IgM(Lebtospira)

白靈側(cè)耳（白靈菇）羅丹明標(biāo)記雞IgGAnti-KCNQ4 Antibody人鉤端螺旋體IgG(Lep IgG)

串珠鐮孢*羅丹明標(biāo)記雞IgMAnti-KCNT1 Antibody人鉤端螺旋體IgG(Lep IgG)

布蘭克假絲酵母羅丹明標(biāo)記狗IgGAnti-KCNQ4 Antibody人阿巴(Amebiasis)

平常假絲酵母羅丹明標(biāo)記羊IgMAnti-KCNT1 Antibody人阿巴(Amebiasis)

單生雞腿10羅丹明標(biāo)記豚鼠IgGAnti-KCNS2 Antibody人白喉抗體(Diphtheria Ab)

帶小棒鏈霉菌羅丹明標(biāo)記豚鼠IgMAnti-KCNV2 Antibody人白喉抗體(Diphtheria Ab)

構(gòu)巢曲霉羅丹明標(biāo)記馬IgGAnti-KCTD7 Antibody人囊蟲(chóng)病抗體(CYT Ab)

傳染性喉氣管炎病羅丹明標(biāo)記馬IgMAnti-KCNV2 Antibody人囊蟲(chóng)病抗體(CYT Ab)

鏈霉菌羅丹明標(biāo)記人IgGAnti-KDELR2 Antibody人布魯氏菌抗體IgG(Brucella Ab IgG)

波羅的海西瓦氏菌羅丹明標(biāo)記人IgMAnti-KDELR3 Antibody人布魯氏菌抗體IgG(Brucella Ab IgG)

癌基因RAS相關(guān)蛋白R(shí)ab4A抗體粗毛斗菇人橫紋肌肉瘤細(xì)胞

ATP調(diào)節(jié)鉀離子通道ROMK抗體靈芝(紅芝，赤芝)人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞

G蛋白GTP-GDP解離刺激因子1抗體凸圓靈芝(白芝)GFP標(biāo)記的小鼠子宮頸癌細(xì)胞

鳥(niǎo)核交換因子rasgef1a抗體橢圓釀酒酵母人喉表皮樣癌細(xì)胞
自噬激酶ULK1抑制劑(SBI-0206965)錐形赤褶菇2-2 EC肉湯顆粒堿性磷

胡頹子殼囊孢 SS瓊脂顆粒降鈣

根瘤堿性蛋白胨水顆粒降鈣原

黑木耳(黑29) 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基顆粒膠原I

枯草芽孢桿枯草亞種月桂基硫鹽胰蛋白胨肉湯（LST）顆粒角蛋白16

溶桿煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)顆粒結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

假單胞屬乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基顆粒結(jié)合珠蛋白

淀粉產(chǎn)色鏈霉結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）顆粒金屬硫蛋白

枯草芽孢桿枯草亞種鹽胱增液（SC）顆粒金屬肽含血小板反應(yīng)蛋白1

氈毛青霉四硫磺鹽煌綠增液基礎(chǔ)（TTB）顆粒晶體蛋白α

枯草芽孢桿枯草亞種 Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)顆粒晶體蛋白α抗體

紅球 7.5%肉湯顆粒精加壓

貝葉多孔孟加拉紅培養(yǎng)基顆粒巨噬炎性蛋白-1α

黑曲霉胰蛋白胨大豆瓊脂顆?？剐粤?/span>

白黃小脆柄菇腦心浸出液肉湯（BHI）顆粒抗性磷5b
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)