程序性壞死抑制劑(Necrostatin 2)-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X10864

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

中文名稱：程序性壞死抑制劑(Necrostatin 2)

英文名稱：Necrostatin 2

產品規(guī)格：1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg

貨號：FS-X10864

產品介紹:

Necrostatin2是一種有效的程序性壞死(necroptosis)抑制劑。作用于TNF-α處理的FADD缺陷型Jurkat T細胞，抑制程序性壞死，EC50為0.05μM。

注：本品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號：852391-19-6

純度：99.89%

分子量：277.71

儲存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請盡量在一個月內使用。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

蟲草屬小鼠β葡萄糖Anti-RAPGEF1 Antibody人抗釀酒酵母抗體(ASCA)

鳥芽孢桿菌屬大鼠高遷移率族蛋白B1Anti-RASGRF1 Antibody人抗釀酒酵母抗體(ASCA)

芽胞桿菌ATCC 9372；（曾用名：枯草芽胞桿菌黑色變種）大鼠相關血漿蛋白AAnti-RASGRF1 Antibody人遲現(xiàn)抗原4(VLA4)

多變毛霉人膽囊收縮/腸促胰肽Anti-RASLA Antibody人遲現(xiàn)抗原4(VLA4)

粉紅擲孢酵母小鼠谷脫羧自身抗體Anti-RAPGEF5 Antibody人吖啶橙(AO)

黑曲霉大鼠內皮脂肪Anti-RASD2 Antibody人吖啶橙(AO)

尖鐮孢菌人Ⅲ型前膠原肽Anti-RASSF4 Antibody人喋呤(MTX)

氣單胞菌小鼠雌二受體Anti-RAX Antibody 人喋呤(MTX)

微紫青霉大鼠碳酐Anti-RASLB Antibody人對基甲(PABA)

南海桿狀菌人Ⅱ型膠原Anti-RASSF6 Antibody人對基甲(PABA)

嗜熱鏈球菌小鼠半乳糖6硫酯Anti-RBFOX3 Antibody人(LPA)

栓菌屬大鼠降鈣基因相關肽Anti-RBL2 Antibody人(LPA)

Winogradskyella eximia小鼠甲狀旁腺激相關蛋白Anti-RBBP8 Antibody人免疫核糖核(Irna)

植物乳桿菌大鼠胃動Anti-RBM20 Antibody人免疫核糖核(Irna)

枇杷鏈格孢小鼠Anti-RBFOX3 Antibody人β萘(β-Nph)

球孢白僵菌人Ⅰ型前膠原羧基端肽Anti-RBAK Antibody人β萘(β-Nph)

硫氧環(huán)蛋白還原1抗體尖孢鐮刀菌黃瓜?；停ㄐ泵妫┤搜乐苣こ衫w維細胞

絲/蘇激TLK2抗體尖鐮孢菌（斜面）人腎小球系膜細胞

共濟失調毛細血管擴張癥D相關蛋白抗體木蹄層孔菌（斜面）人多發(fā)性骨髓瘤細胞

轉化生長因子β調節(jié)蛋白4抗體禾谷鐮刀菌(斜面）人霍奇金淋巴瘤細胞
程序性壞死抑制劑(Necrostatin 2)枯草芽胞桿衛(wèi)矛半固體碳酐III

洛斯里被毛孢 MR-VP大腸桿抗體

微桿 Korser氏肉湯低分子肝抗Xa

枯草芽孢桿乳糖發(fā)酵管低分子肝抗IIa

曲霉色肉湯糖原磷化

海洋桿半固體瓊脂2,6-二磷果糖

黃硬皮馬勃甘露發(fā)酵管磷化腺活化蛋白激

豌豆根瘤尿膽囊收縮

球形賴芽孢桿氨基脫羧對照胃饑餓

雅氏艾美耳球蟲乳糖發(fā)酵管促腎上腺皮質釋放因子

芽孢桿賴脫羧肉湯去甲腎上腺

血紅密孔 Elek氏培養(yǎng)基甘油-3-磷脫氫

淺黃褐濕傘木糖發(fā)酵管α半乳糖基抗原

犬種布魯氏病陽性血清蛋白胨水（色肉湯）乳糖

豬鼻支原體弧顯色培養(yǎng)基乳脂
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)