ELISA方法學(xué)開(kāi)發(fā)之競(jìng)爭(zhēng)法

ELISA競(jìng)爭(zhēng)法方法學(xué)開(kāi)發(fā)
一般來(lái)講，競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)驗(yàn)主要涉及到三個(gè)物質(zhì)，受體，配體和阻斷配體受體結(jié)合的樣品，如PD1受體，PD-L1配體，阻斷劑keyturda抗體，也常采用抗原，生物素化抗體，和阻斷抗原，生物素化抗體的樣品抗體組合。在競(jìng)爭(zhēng)法開(kāi)發(fā)的初期是建立起受體，配體相互作用的Test system。Test system的條件直接決定了競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和測(cè)量范圍。具體到ELISA競(jìng)爭(zhēng)法方法開(kāi)發(fā)上，主要包含兩個(gè)方面：

1.設(shè)置多個(gè)陰性陽(yáng)性對(duì)照組，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)信號(hào)值是真實(shí)代表目標(biāo)分子配體受體偶聯(lián)物。主要考察的是在間接的檢測(cè)過(guò)程中ELISA反應(yīng)過(guò)程采用的酶標(biāo)板材，酶聯(lián)抗體和顯色液等試劑耗材是否干擾Test system。如下圖所示，嚴(yán)格來(lái)講在新建一個(gè)ELISA方法時(shí)，需要建立一個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)組組5，需要建立多個(gè)陰性對(duì)照組組1-組4來(lái)確認(rèn)Test system中信號(hào)是和目標(biāo)分子相關(guān)。這是一個(gè)十分重要，也是十分容易被忽略的問(wèn)題。除了組5能夠得較高的陽(yáng)性信號(hào)，其他分組如果得到較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào)，整個(gè)方法得到的數(shù)據(jù)都是不可信的。組3和組5（黃色）是ELISA實(shí)驗(yàn)常用的對(duì)照組，但是組4（藍(lán)色）的缺席會(huì)使得整個(gè)方法充滿分險(xiǎn)性，小編多個(gè)不同ELISA應(yīng)用方法學(xué)開(kāi)發(fā)的經(jīng)驗(yàn)表明，很多時(shí)候封閉劑起無(wú)法達(dá)到占據(jù)酶標(biāo)板材空白位置的目的，反應(yīng)配體或者反應(yīng)配體中的非特異成分可能會(huì)直接吸附在酶標(biāo)板材上，導(dǎo)致組4出現(xiàn)劑量依賴的假陽(yáng)性信號(hào)。在雜交瘤和噬菌體展示篩選測(cè)定時(shí)，反應(yīng)配體溶液的復(fù)雜和多樣性，使得配體溶液總會(huì)存在某些陰性抗體或者克隆能夠和酶標(biāo)板材結(jié)合，成分組4的缺席會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性克隆出現(xiàn)的頻率大大增加。設(shè)置比較全的陰性對(duì)照組也有助于鎖定整個(gè)體系中哪些試劑發(fā)生了交叉反應(yīng)，找到具體原因，方便更換試劑。 

2.包被受體相對(duì)于反應(yīng)配體的劑量曲線。在確認(rèn)Test system中陽(yáng)性信號(hào)能夠代表目標(biāo)檢測(cè)分子后，包被少量的受體，2倍梯度稀釋反應(yīng)配體12-16個(gè)點(diǎn)進(jìn)行全曲線擬合，選取EC80或者EC50的配體濃度作為競(jìng)爭(zhēng)法反應(yīng)濃度。如下圖所示100ng/ml 受體100ul包被，受體從100000ng/ml 2倍梯度稀釋到0.2ng/ml，采用不同稀釋濃度的酶聯(lián)抗體進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)劑量曲線有明顯的上，下平臺(tái)期，不同的酶聯(lián)濃度對(duì)信號(hào)的線性傳遞未造成明顯的影響，酶聯(lián)抗體起到了等比例將信號(hào)放大的作用，EC50為12ng/ml，EC80為40ng/ml?？蛇x取100ng/ml 受體100ul包被，配體的競(jìng)爭(zhēng)濃度選EC80為40ng/ml，酶聯(lián)稀釋度選擇1：600以獲得較大的信噪比窗口，增加方法測(cè)量范圍。在競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)驗(yàn)中EC80代表了配體在Test system中占據(jù)了受體80%的結(jié)合位點(diǎn)，配體和受體在此相對(duì)狀態(tài)下，樣品對(duì)配體和受體的反應(yīng)的阻斷比較敏感。受體過(guò)多，可提供的結(jié)合位點(diǎn)較多，樣品和受體結(jié)合不會(huì)影響到配體和受體的結(jié)合；配體過(guò)多，樣品加入后相對(duì)于配體較少，競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)配體，絕大多數(shù)配體依舊和受體結(jié)合，在兩種情況下樣品的加入都無(wú)法導(dǎo)致Test system發(fā)生明顯的變化（配體受體偶聯(lián)物減少），信號(hào)變化不明顯。 

建立好完整的Test system后，就是正式建立競(jìng)爭(zhēng)法的劑量曲線了。主要包含兩個(gè)方面的內(nèi)容

1.將選定EC80濃度的配體和梯度稀釋的樣品（2倍梯度稀釋12-16個(gè)點(diǎn)）混勻后加入包被好受體的酶標(biāo)板材反應(yīng)，得到有明顯上下漸近線的全曲線，如下圖所示。 

2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行，選擇樣品合適的8個(gè)濃度梯度點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作流程，并初步評(píng)估方法的質(zhì)量。具體到應(yīng)用方面就是親和力大小比較和定量檢測(cè)方面。根據(jù)筆者的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法相同條件下的同一個(gè)曲線在濃度點(diǎn)細(xì)微調(diào)整下能夠滿足兩方面的需求，這是筆者開(kāi)創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，希望業(yè)界更多的同行能夠進(jìn)行驗(yàn)證。下文會(huì)具體進(jìn)行兩方面應(yīng)用方法的初步評(píng)估。

ELISA競(jìng)爭(zhēng)法方法學(xué)質(zhì)量的初步驗(yàn)證
當(dāng)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法開(kāi)發(fā)以親和力大小比較為目的，往往會(huì)以IC50值評(píng)價(jià)待測(cè)樣品阻斷配體受體結(jié)合效果，IC50越小，待測(cè)樣品的阻斷效果越好。親和力競(jìng)爭(zhēng)法開(kāi)發(fā)的劑量曲線應(yīng)該有明顯的上下平臺(tái)期以得到較為穩(wěn)定的IC50值。生物學(xué)活性的方法學(xué)驗(yàn)證可參照USP1032, 1033,1034來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。具體到ELISA競(jìng)爭(zhēng)法的方法學(xué)評(píng)價(jià)，即制備相對(duì)于對(duì)照品理論效價(jià)為156%，125%，，80%，64%的樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較對(duì)照品和樣品的IC50，得到樣品相對(duì)于實(shí)測(cè)效價(jià)，通過(guò)實(shí)測(cè)效價(jià)和理論效價(jià)的差異初步確認(rèn)以親和力大小比較為目的的ELISA競(jìng)爭(zhēng)法的質(zhì)量。承接上文的全曲線選擇合適的8個(gè)濃度點(diǎn)，進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果如下圖所示：該單次實(shí)驗(yàn)如果進(jìn)行多人和關(guān)鍵試劑的多批次實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)測(cè)效價(jià)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將構(gòu)成方法學(xué)驗(yàn)證中主要的幾個(gè)概念，精密度，準(zhǔn)確度，線性和范圍。如結(jié)果顯示單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)測(cè)效價(jià)和理論效價(jià)的差異在5%以內(nèi)，能夠初步判斷該以親和力大小比較為目的ELISA競(jìng)爭(zhēng)法有較好的方法質(zhì)量。 

當(dāng)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法開(kāi)發(fā)以定量為目的，選取7個(gè)點(diǎn)以理論濃度為X軸，信號(hào)值為Y軸進(jìn)行四參數(shù)函數(shù)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，將對(duì)照品的信號(hào)值重新代入標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回測(cè)濃度值，多次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析后回測(cè)濃度值和理論值的偏差決定了該條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)上限，檢測(cè)下限，測(cè)量范圍，更加詳盡的方法學(xué)驗(yàn)證可參照2015版中國(guó)藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國(guó)FDAxin版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation相關(guān)論述。如下圖所示，對(duì)照品在12.5ng/ml-10000ng/ml較大的濃度范圍內(nèi)，回測(cè)濃度值和理論濃度的偏差在20%以內(nèi)，初步能夠判斷該方法具備較好的質(zhì)量。需要說(shuō)明的此定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅僅是將親和力大小比較的劑量曲線刪除了上平臺(tái)期的低濃度點(diǎn)。筆者大量的實(shí)踐表明定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線明確的平臺(tái)期點(diǎn)會(huì)嚴(yán)重干擾標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量準(zhǔn)確性。

總結(jié)和展望
本文以ELISA競(jìng)爭(zhēng)法方法學(xué)開(kāi)發(fā)和初步方法學(xué)驗(yàn)證的案例概論了功能學(xué)實(shí)驗(yàn)和定量實(shí)驗(yàn)的通用原則，包含以下幾個(gè)步驟：

1. 鑒于生物學(xué)方法的雙重間接性，明確檢測(cè)的目標(biāo)分子，設(shè)置多個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，理清信號(hào)值和檢測(cè)目標(biāo)分子的線性聯(lián)系；

2. 建立Test system，通過(guò)配體受體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，尋找合適的配體受體相對(duì)濃度以得到樣品對(duì)Test system的敏感性；

3. 加入梯度稀釋的樣品進(jìn)入Test system，繪制樣品相對(duì)于Test system的劑量全曲線；

4. 以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑閷?dǎo)向，分別對(duì)親和力大小比較為目的和大分子定量為目的進(jìn)行差異的濃度點(diǎn)選擇，并通過(guò)合規(guī)的方法學(xué)評(píng)價(jià)程序?qū)Ψ椒ǖ馁|(zhì)量進(jìn)行初步的評(píng)價(jià)。 

ELISA直接法和ELISA競(jìng)爭(zhēng)法有相同的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)，即親和力大小比較的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)USP1032,1033,1034；定量分析的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)2015版中國(guó)藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國(guó)FDAxin版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。ELISA競(jìng)爭(zhēng)法在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)于對(duì)照品濃度點(diǎn)的微調(diào)可以完成親和力大小比較和大分子定量?jī)煞矫鎽?yīng)用，這個(gè)有別于筆者之前的文章ELISA技術(shù)應(yīng)用概覽和方法學(xué)開(kāi)發(fā)初析對(duì)于ELISA直接法兩方面不同應(yīng)用不同的實(shí)驗(yàn)條件，但是兩類方法的四種應(yīng)用均能夠通過(guò)驗(yàn)證符合標(biāo)準(zhǔn)要求，只能說(shuō)實(shí)踐出真知，不管白貓黑貓，能抓住老鼠的就是好貓了。

在體外所有的體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中，樣品引起檢測(cè)體系的變化，并以信號(hào)的形式展示出來(lái)，這個(gè)應(yīng)該是體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法通用的原則，有結(jié)合才會(huì)有功能，功能是對(duì)藥物引起的變化（響應(yīng)標(biāo)志物）的準(zhǔn)確定量。理解ELISA實(shí)驗(yàn)關(guān)于結(jié)合和定量的應(yīng)用以及方法質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于所有的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)發(fā)和評(píng)價(jià)都有著十分重要的借鑒意義，ELISA里面有乾坤。