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常規(guī)人正常組織細(xì)胞培養(yǎng)法

時間:2017/8/10閱讀:187
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1、人正常組織細(xì)胞初代消化培養(yǎng)法
(1)準(zhǔn)備:取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面,紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
(2)布局:點(diǎn)燃酒精燈,安裝吸管帽。
(3)處理組織:把組織塊置于燒杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。
(4)剪切:用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊,以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。
(5)消化:或用恒溫水浴,或置于37℃溫箱消化均可,消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次,如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。
(6)分離:在消化過程中見消化液發(fā)混濁時,可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速(500~1000轉(zhuǎn)/分)離心消化液5分鐘,吸出上清,加入適量含有血清的培養(yǎng)液。
(7)計數(shù):用計數(shù)板計數(shù),如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大,再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后,分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細(xì)胞來說,pH要求在7.2~7.4范圍,培養(yǎng)液呈微紅色,如顏色偏黃,說明液體變酸,可用NaHCO3調(diào)整。
(8)培養(yǎng):置于36.5℃溫箱培養(yǎng),如用CO2溫箱培養(yǎng),瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞,紗布塞易生霉菌,每次換液時需要換新塞。
2、初代組織塊培養(yǎng)法
(1)剪切:把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸靜Hanks液,用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。
(2)擺布:用彎頭吸管吸取若干小塊,置于培養(yǎng)瓶中,用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部,小塊相互距離以0.5cm為宜,每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。
(3)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,另瓶底向上,注意翻瓶時勿另組織小塊流動,塞好瓶塞,置36.5℃溫箱培養(yǎng)2小時左右(勿超過4小時),使小塊微干涸。
(4)培養(yǎng):從微箱中取出培養(yǎng)瓶,開塞,46度斜持培養(yǎng)瓶,箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許,然后人正常組織細(xì)胞緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來,讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補(bǔ)加培養(yǎng)液。
(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-半胱氨酸    進(jìn)口、國產(chǎn)    英文名稱:    L-Cystathionine    含量:    BR,90%
H-半胱氨酸-甘氨酸-OH    進(jìn)口、國產(chǎn)    英文名稱:    Cys-Gly    含量:    BR,98%
聚賴氨酸    進(jìn)口、國產(chǎn)    英文名稱:    ε-PL    含量:    BR,95%
α-糜蛋白酶    進(jìn)口、國產(chǎn)    英文名稱:     α-Chymotrypsin(bovine)    含量:    USP級,1500USP u/mg
中溫淀粉酶    進(jìn)口、國產(chǎn)    英文名稱:    糊精化酶    含量:    BR,4000u/g
高峰淀粉酶    進(jìn)口、國產(chǎn)    英文名稱:    α-Amylase from Aspergillus oryzae    含量:    生物技術(shù)級,50u/mg
人正常組織細(xì)胞

 

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