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PCR實(shí)驗(yàn)步驟:
典型的PCR由(1)高溫變性模板;(2)引物與模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán),通過多次循環(huán)反應(yīng),使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。
其主要步驟是:
將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈;
人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合,兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長短;
耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入,以目的基因?yàn)槟0鍙?/span>5’→3’方向延伸,合成DNA的新互補(bǔ)鏈。
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具有下列特點(diǎn):
1.即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板,操作簡單,定量準(zhǔn)確快速。
2. 引物經(jīng)過優(yōu)化,特異性強(qiáng)。預(yù)期的 PCR 產(chǎn)物長度為 560 bp。
3. PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳。
4. 提供陽性對照,便于分析試驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品名稱 | 海鷗彎曲菌熒光PCR法檢測試劑盒 |
規(guī)格 | 50T |
貨號 | CP99373 |
特點(diǎn)優(yōu)勢:
1. 特異性:所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息學(xué)分析,經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫的比對,確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段,可實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌種屬及血清型的特異檢測,特異性均達(dá)到100%。
2. 重現(xiàn)性:該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)菌株的驗(yàn)證,重現(xiàn)性為100%。
3. 靈敏性:該系列產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)對檢測菌的高靈敏檢測,當(dāng)樣品中細(xì)菌的濃度達(dá)到103cfu/ml時,可實(shí)現(xiàn)對其的直接檢測,無需繁瑣的增菌過程。
4. 實(shí)用性:檢測范圍廣,涵蓋了對人體危害較為嚴(yán)重的17種呼吸道及腸道致病菌,可實(shí)現(xiàn)對臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測,整個檢測過程為3-4個小時。
5. 優(yōu)勢1:序列資源豐富,除GenBank公布的序列外,公司還進(jìn)行了大量菌株的序列破譯,從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。
6. 優(yōu)勢2:該系列試劑盒均經(jīng)過大量的保守性及特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,憑借公司擁有的豐富的菌種資源,每一種檢測試劑盒均經(jīng)過了20余種標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的保守性驗(yàn)證及40余種近緣標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的特異性驗(yàn)證,確保在使用過程中不會出現(xiàn)任何的假陽性及假陰性報(bào)告結(jié)果。
反應(yīng)五要素:
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn), 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟:
①取凍存已裂解的細(xì)胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混勻后,4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,使其*溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。
1098-60-8 Triflupromazine hydrochloride 100mg Oesophagostomum clumbianum克氏食道線蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度
1098-60-8 Triflupromazine hydrochloride 10mM*1mLinDMSO Oesophagostomum clumbianum克氏食道線蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度
109889-09-0 Granisetron 100mg O'nyong-nyong Virus(ONNV)阿尼昂-尼昂病毒RT-LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度
109889-09-0 Granisetron 50mg Eimeria spp.艾美耳球蟲屬通用LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度
109889-09-0 Granisetron 5mg Eimeria spp.艾美耳球蟲屬通用LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度
亞精胺Spermidine質(zhì)量規(guī)格:>99%,進(jìn)分 RatCollagenaseTypeIIELISA試劑盒大鼠膠原酶II(CollagenaseII)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T 腺苷三1酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ABCG2)ELISA試劑盒 ,英文名: ABCG2 ELISA Kit
亞精胺1酸鹽Spermidine phosphate salt hexahydrate 質(zhì)量規(guī)格:>98%(T),進(jìn)口原裝 小鼠苗條素(LEP)ELISA試劑盒 ,英文名: LEP ELISA Kit Mouseierleukin10,IL-10ELISA試劑盒小鼠白介素10(IL-10)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
半乳糖(標(biāo)準(zhǔn)品)D-GALACTOSE 1-[2-(2-AZIDOETHOXY)ETHOXYETHYL]-2,3,4,6-TETRA-O-ACETATE質(zhì)量規(guī)格:供檢查用 雞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸1酸(NADPH)ELISA檢測試劑盒Chickennicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPHELISAKit 96T/48T ELISAKitCollagenaseII兔子膠原酶II規(guī)格:48T/96T
富馬酸氯馬斯?。?biāo)準(zhǔn)品)Clemastine fumarate質(zhì)量規(guī)格:HPLC含量測定 人5羥二十碳四烯酸(5-HETE)試劑盒 Human 5-hydroxyeicosateaenoic acid,5-HETE ELISA Kit ChickenLaminin,LNELISAKit雞層連蛋白/板層素(LN)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
海鷗彎曲菌熒光PCR法檢測試劑盒COS-7非洲綠猴SV40轉(zhuǎn)化的腎細(xì)胞 Renal cell COS-7 in African green monkey SV40 ansformation DMEM培養(yǎng)基+10%FBS硬脂酸質(zhì)量規(guī)格:BRLead (II) stearate
IFNA2 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 IFNA2 / Ierferon alpha 2 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)硫酸(>99%,BC)質(zhì)量規(guī)格:>99%,BCLead (II) sulfate
K7M2 wt(小鼠骨肉瘤成骨細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 溶組織梭菌Closidium histolyticum左旋多巴(標(biāo)準(zhǔn)品)質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品L-dopa,Levodopa
大隱靜脈平滑肌細(xì)胞Many types of cells包裝:5 × 105方(1ml)左旋多巴質(zhì)量規(guī)格:HPLC>97%,BRL-dopa
MET Others Cynomolgus 食蟹猴 / 恒河猴 c-MET / HGFR 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) L-a-氨基己二酸質(zhì)量規(guī)格:>98%,BRL-a-Aminoadipic acid
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