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iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)是由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。iTRAQ技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較最多10種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來(lái)定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。

原理簡(jiǎn)介

iTRAQ技術(shù)采用4種或8種同位素編碼的標(biāo)簽，通過(guò)對(duì)氨基酸N端和賴氨酸殘基進(jìn)行酶解后用iTRAQ試劑進(jìn)行特異性標(biāo)記，而后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。

iTRAQ試劑包括3個(gè)部分：報(bào)告基團(tuán)（Report group）、平衡基團(tuán)（Balance group）和肽反應(yīng)基團(tuán)（Amine-specific reactive group）。報(bào)告基團(tuán)相對(duì)分子質(zhì)量為113-121Da（無(wú)120），因此iTRAQ試劑可同時(shí)標(biāo)記8組樣品。平衡基團(tuán)相對(duì)分子質(zhì)量為192-184Da（無(wú)185），使得八種iTRAQ試劑分子量均為305Da，保證標(biāo)記的同一肽段質(zhì)荷比（m/z）相同。肽反應(yīng)基團(tuán)將iTRAQ試劑與肽段的N端及賴氨酸的氨基特異結(jié)合，在其上報(bào)告基團(tuán)通過(guò)平衡基團(tuán)與反應(yīng)基團(tuán)相連，形成等量異位標(biāo)簽。

在串聯(lián)質(zhì)譜中，來(lái)自不同樣品的同一肽段由于是等質(zhì)量的，在一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)（MS1）中表現(xiàn)為一個(gè)母離子峰（即同一個(gè)質(zhì)譜峰），在二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)（MS2）中進(jìn)一步碎裂時(shí)，報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多肽反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團(tuán)丟失，報(bào)告基團(tuán)則會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的不同質(zhì)量數(shù)的報(bào)告離子，它們各自質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)弱，代表著來(lái)源于不同樣品的該肽段及其所對(duì)應(yīng)的蛋白的表達(dá)量的高低。因此，根據(jù)報(bào)告離子的信號(hào)強(qiáng)度值即可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過(guò)軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息。同時(shí)，多肽內(nèi)的酰胺鍵斷裂，形成一系列b離子和y離子，得到離子片段的質(zhì)量數(shù)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢和比較，可以鑒定出相應(yīng)的蛋白質(zhì)前體。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提取和質(zhì)控——iTRAQ標(biāo)記肽段——HPLC分級(jí)——質(zhì)譜分析——數(shù)據(jù)庫(kù)處理——生物信息學(xué)分析

圖1 iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程圖。

TMT（Tandem Mass Tag）技術(shù)是由美國(guó)Thermo Scientific公司研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。與iTRAQ技術(shù)原理相同，優(yōu)勢(shì)類似，但是比iTRAQ擁有更多的標(biāo)簽數(shù)，能一次上機(jī)更多樣品。

原理簡(jiǎn)介

TMT技術(shù)采用2種、6種、10種或16種同位素標(biāo)簽，特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，監(jiān)測(cè)碎裂下來(lái)的標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)肽段定量。一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)比較最多16組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。

TMT標(biāo)簽由三部分組成：分子量報(bào)告子（報(bào)告基團(tuán)）、分子量標(biāo)準(zhǔn)化部分（平衡基團(tuán)）和（肽）反應(yīng)基團(tuán)，形成2種、6種、10種或16種相對(duì)分子質(zhì)量均為等量的異位標(biāo)簽。TMT試劑通過(guò)反應(yīng)基團(tuán)與肽段上賴氨酸及N端氨基酸殘基相連，能夠高效地標(biāo)記酶解后的肽段。在一級(jí)質(zhì)譜中，分子量標(biāo)準(zhǔn)化部分使任何一種TMT試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一肽段表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在二級(jí)質(zhì)譜中，釋放出分子量報(bào)告子。每個(gè)報(bào)告子都有各自du特的分子量，產(chǎn)生不同的報(bào)告離子峰，其強(qiáng)度反應(yīng)了該肽段在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量信息，另外二級(jí)質(zhì)譜中的肽段碎片離子峰質(zhì)荷比反應(yīng)了該肽段的序列信息，根據(jù)這些質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)可得到蛋白質(zhì)的定性和相對(duì)定量信息。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提取和質(zhì)控——TMT標(biāo)記肽段——HPLC分級(jí)——質(zhì)譜分析——數(shù)據(jù)庫(kù)處理——生物信息學(xué)分析

SILAC即細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)。SILAC是一種通過(guò)使用13C-葡萄糖、15NH或3C標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基引入穩(wěn)定同位素，標(biāo)記細(xì)胞或小生物體內(nèi)的蛋白并根據(jù)質(zhì)譜豐度比率進(jìn)行定量的體內(nèi)代謝標(biāo)記技術(shù)。

最初SILAC使用的標(biāo)記氨基酸是氚代jia硫an酸和氘代甘an酸，目前常用的標(biāo)記氨基酸有亮an酸、精an酸、賴氨酸、甲硫an酸和酪an酸等。

原理簡(jiǎn)介

在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入天然同位素（輕型）或穩(wěn)定同位素（重型）標(biāo)記的必需氨基酸，替代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)的氨基酸，細(xì)胞經(jīng)若干傳代后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸wan全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中，取代了原有的氨基酸。這樣，兩個(gè)蛋白之間就存在分子量的改變，而其它化學(xué)性質(zhì)無(wú)異。然后將兩組細(xì)胞混合，提取蛋白質(zhì)，經(jīng)分離純化后進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。

每個(gè)肽段作為質(zhì)譜中的一對(duì)：低分子量的肽段含有輕型氨基酸，來(lái)源于A組，高分子量的肽段則含有重型氨基酸，來(lái)源于B組。如果SILAC肽段對(duì)呈現(xiàn)1：1的比例，則蛋白質(zhì)組中此蛋白的豐度無(wú)差異。如果含有重型氨基酸的肽段峰強(qiáng)度偏高，則說(shuō)明B組中蛋白豐度更高。因?yàn)榉€(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸與天然氨基酸的化學(xué)性質(zhì)基本相同，除了分子量有差異。因此，質(zhì)譜上峰強(qiáng)度的比值直接對(duì)應(yīng)了A組與B組的比例，即可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。

實(shí)驗(yàn)流程

細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記——蛋白提純——1:1混合蛋白樣品——蛋白還原、酶切——LC-MS液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)——生物信息學(xué)分析

圖2 SILAC實(shí)驗(yàn)流程圖。

蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)（Label-free）是經(jīng)典的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。該技術(shù)無(wú)需昂貴的同位素（iTRAQ和TMT）標(biāo)簽做內(nèi)標(biāo)，而是通過(guò)比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強(qiáng)度，分析不同來(lái)源樣品蛋白的數(shù)量變化。該方法認(rèn)為肽段在質(zhì)譜中被捕獲檢測(cè)的頻率與其在混合物中的豐度成正相關(guān)，因此蛋白質(zhì)被質(zhì)譜檢測(cè)的計(jì)數(shù)反映了蛋白質(zhì)的豐度，通過(guò)適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)公式可以將質(zhì)譜檢測(cè)計(jì)數(shù)與蛋白質(zhì)的量聯(lián)系起來(lái)，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。

原理簡(jiǎn)介

Label-free通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，按照其原理主要分為兩種，di一種Spectrum counts類的非標(biāo)記方法，發(fā)展比較早，已經(jīng)形成多種定量算法。其主要的原理是以MS2的鑒定結(jié)果為定量基礎(chǔ)，各種方法的差別在于后期算法在大規(guī)模數(shù)據(jù)上的修正。第二種非標(biāo)記定量的原理是以MS1為基礎(chǔ)，計(jì)算每個(gè)肽段的信號(hào)強(qiáng)度在LC-MS上的積分（如Maxquant），以積分面積對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提取——蛋白酶解——高效液相HPLC預(yù)分離——MS質(zhì)譜分離——原始數(shù)據(jù)搜庫(kù)分析——生物信息學(xué)分析

圖3 Label-free實(shí)驗(yàn)流程圖。

DIA（Data-independent acquisition）技術(shù)是瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Ruedi Aebersold博士及其團(tuán)隊(duì)與AB-SCIEX公司聯(lián)合研發(fā)的一項(xiàng)全新質(zhì)譜技術(shù)，而SWATH（Sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions）便是基于DIA采集模式的一種新技術(shù)。

DIA采集模式將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)小窗口，然后依次對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行檢測(cè)、碎裂，使其能夠?qū)呙鑵^(qū)間內(nèi)的所有肽段離子進(jìn)行高速一級(jí)MS掃描，再進(jìn)行二級(jí)MS/MS分析，從而無(wú)遺漏、無(wú)差異地獲得樣本中所有離子的信息，在碎片離子層面完整重現(xiàn)nanoLC的色譜峰圖，因此DIA定量可以利用碎片離子隨時(shí)間的積分來(lái)表征肽段含量，而利用二級(jí)碎片離子定量不僅可以降低樣本檢測(cè)的缺失值，同時(shí)提高定量準(zhǔn)確性和重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)大樣本隊(duì)列中高覆蓋率，高穩(wěn)定，高精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)組定量分析。但本質(zhì)上，DIA也是一種Label-free定量方法。

原理簡(jiǎn)介

DIA/SWATH技術(shù)將掃描范圍劃分為以25 Dalton為間隔的一系列區(qū)間，通過(guò)超高速掃描來(lái)獲得掃描范圍內(nèi)全部離子的所有碎片信息。以蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分析中常見(jiàn)的掃描范圍400~1200為例，每25 Dalton作為一個(gè)掃描間隔（SWATH），每個(gè)SWATH掃描時(shí)間設(shè)定為100 ms，那么該掃描范圍累計(jì)需要32個(gè)SWATH（1200-400/25=32），完成一次掃描僅需要3.2秒。

與傳統(tǒng)的shotgun技術(shù)相比，SWATH技術(shù)能夠?qū)呙鑵^(qū)間內(nèi)所有的肽段母離子經(jīng)過(guò)超高速掃描并進(jìn)行二級(jí)碎裂，使用二級(jí)碎片離子進(jìn)行蛋白相對(duì)/jue對(duì)定量，從而獲得完整的肽段信息。

目前SWATH可以根據(jù)樣品TIC分布進(jìn)行窗口優(yōu)化，從而獲取更多的譜圖信息，提高了精準(zhǔn)度和分辨率。通過(guò)高分辨高靈敏質(zhì)譜TripleTOF 5600/+以及zuixin的TripleTOF 6600進(jìn)行分析掃描。因此，SWATH技術(shù)是一種真正全景式的、高通量的質(zhì)譜技術(shù)，同時(shí)也解決了shotgun鑒定重復(fù)度較低的缺點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提純——蛋白還原、酶切——HPLC分離肽段——LC-SWATH模式質(zhì)譜檢測(cè)——OpenMS分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)——生物信息學(xué)分析

圖4 SWATH實(shí)驗(yàn)流程圖。