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2024年3月6日，林木遺傳育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院尹偉倫與夏新莉教授課題組在New Phytologist（中科院一區(qū)，影響因子9.4）期刊發(fā)表了題為“The miR6445-NAC029 module regulates drought tolerance by regulating the expression of glutathione S-transferase U23 and reactive oxygen species scavenging in Populus”的研究論文，揭示了miR6445-NAC029-GSTU23模塊通過調(diào)節(jié)活性氧穩(wěn)態(tài)在提高楊樹抗旱性中的關(guān)鍵作用。

前期研究表明miR6445是楊樹特異性miRNA，它可以靶向NAC (NAM、ATAF和CUC) 家族基因，然而，在楊樹中，miR6445和NAC基因相互作用的生物學(xué)功能尚不清楚。該研究發(fā)現(xiàn)了miR6445-NAC029調(diào)控模塊參與楊樹干旱脅迫響應(yīng)中的作用。miR6445和NAC029都對干旱脅迫都有響應(yīng)，但表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式?；诙檀?lián)靶模擬物 (STTM) 誘導(dǎo)的基因沉默實(shí)驗(yàn)，證明了miR6445對楊樹干旱脅迫耐受性有正調(diào)控作用。研究人員在楊樹中過表達(dá)及敲除NAC029，發(fā)現(xiàn)NAC029的過表達(dá)導(dǎo)致楊樹干旱敏感性增加，表現(xiàn)為干旱脅迫下植物萎蔫加劇、膜損傷加劇、脂質(zhì)過氧化增加、保水能力降低和光合效率降低，活性氧含量增加。Crispr-NAC029則表現(xiàn)出相反的表型（圖1）。

圖1 NAC029負(fù)向調(diào)控楊樹耐旱性。

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，作者發(fā)現(xiàn)了幾種可能受NAC029調(diào)控的生物學(xué)過程，特別是超氧化物和活性氧代謝過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NAC029可以通過直接靶向并抑制GSTU23活性來調(diào)節(jié)活性氧穩(wěn)態(tài)，從而在干旱脅迫中發(fā)揮作用（圖2）。此外，GSTU23的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了楊樹的抗旱性，表現(xiàn)為干旱脅迫下保持了更好的植株形態(tài)，減少了膜損傷，降低了脂質(zhì)過氧化，改善了光合性能，增強(qiáng)了GST活性，降低了活性氧水平（圖2）。這項(xiàng)研究揭示了一個楊樹的miR6445-NAC029-GSTU23調(diào)控模塊，它可以維持活性氧平衡，這對楊樹的抗旱性至關(guān)重要，這一發(fā)現(xiàn)對楊樹抗旱性遺傳改良提供了新的分子靶點(diǎn)。

圖2 miR6445/NAC029在正常條件和干旱脅迫下的功能調(diào)控模型。

該研究中，對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行深入的分子層面表征是及其關(guān)鍵的。下一代測序（NGS）技術(shù)有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)Southern雜交和PCR方法的不足，不僅能夠快速準(zhǔn)確地測定轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，更能精確揭示其在基因組中的整合。該研究團(tuán)隊(duì)通過基因組重測序技術(shù)（與藍(lán)景科信合作），以高通量、高分辨率的方式分別鑒定了過表達(dá)NAC029、GSTU23株系的基因拷貝數(shù)及插入位點(diǎn)。其中，從OE-NAC029-3楊樹中獲得的跨越宿主基因組與轉(zhuǎn)基因之間連接區(qū)域的讀取序列，發(fā)現(xiàn)與84K WT楊樹中有兩個位置對齊，一個是第16染色體從2968653到2968659堿基對，有6個堿基對的缺失，為反向插入，插入位點(diǎn)位于Pop-A16G089982和Pop-A16G089983兩基因之間；另一個位點(diǎn)是第10染色體從19758803到19758805堿基對，有2個堿基對的缺失，為正向插入，插入位點(diǎn)位于Pop-A10G001190和Pop-A10G001189兩基因之間。是一個雙拷貝事件。OE-NAC029-4楊樹在16號染色體6630336bp處發(fā)現(xiàn)了靠近左側(cè)邊界（LB）的整合位點(diǎn),右邊界附近的側(cè)翼序列（RB）區(qū)域未確定，是一個單拷貝事件，插入位點(diǎn)位于Pop-G16G060808基因內(nèi)部。同樣的，結(jié)果顯示，OE-GSTU-1楊樹轉(zhuǎn)基因被定位在84K楊樹的第5條和第16條染色體上，這是一個雙拷貝事件。在OE-GSTU-2楊樹中，跨越宿主基因組和轉(zhuǎn)基因之間的連接區(qū)域的讀數(shù)被映射到84K楊樹的第3條染色體上，這是一個單拷貝事件。

圖3 轉(zhuǎn)基因株系拷貝數(shù)及插入位點(diǎn)分析。