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作為生物制造上游生產(chǎn)的核心，細(xì)胞培養(yǎng)的強(qiáng)化是實(shí)現(xiàn)整體生物工藝流優(yōu)化的關(guān)鍵，通過(guò)縮短細(xì)胞生長(zhǎng)步驟或減少N階段生物反應(yīng)器的生產(chǎn)時(shí)間，能夠加速生產(chǎn)進(jìn)程。目前，上游細(xì)胞培養(yǎng)主要采用批次培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，其中基于灌流技術(shù)的連續(xù)培養(yǎng)相比傳統(tǒng)批次和補(bǔ)料分批培養(yǎng)展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。灌流培養(yǎng)的過(guò)程強(qiáng)化現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于不穩(wěn)定蛋白和低產(chǎn)量蛋白的生產(chǎn)，且多集中于小規(guī)模操作。盡管灌流技術(shù)在小規(guī)模生產(chǎn)中表現(xiàn)優(yōu)異，其在大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，主要體現(xiàn)在工藝開(kāi)發(fā)的復(fù)雜性、自動(dòng)化控制的高要求以及成本控制方面的難題。

近年來(lái)發(fā)展勢(shì)頭強(qiáng)勁的一種有吸引力且高效的平臺(tái)工藝是強(qiáng)化或高接種密度補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器。該方式接種密度比傳統(tǒng)的補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器高出20倍，這是通過(guò)在N-1階段使用灌注培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生密集的接種源來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這個(gè)過(guò)程將細(xì)胞生長(zhǎng)階段的負(fù)擔(dān)轉(zhuǎn)移到N-1階段，同時(shí)使N階段的生物反應(yīng)器能夠保持高細(xì)胞濃度。由于單克隆抗體的總產(chǎn)量與培養(yǎng)物的總細(xì)胞數(shù)和壽命之間存在直接相關(guān)性，細(xì)胞濃度的增加轉(zhuǎn)化為生物反應(yīng)器總生產(chǎn)率的大幅提高。在過(guò)去的十年中，出現(xiàn)了許多這種制造工藝的例子，與低密度生物反應(yīng)器相比，在接種了10x10^{^6}個(gè)細(xì)胞/mL的生物反應(yīng)器中，滴度提高了100 %。

2020年5月發(fā)表在mAbs上的“Biomanufacturing evolution from conventional to intensified processes for productivity improvement: a case study”文章中，美國(guó)百時(shí)美施貴寶公司分享了一個(gè)從傳統(tǒng)到強(qiáng)化工藝的生產(chǎn)力提升案例，通過(guò)使用CHO細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體，展示了三種工藝的比較：傳統(tǒng)補(bǔ)料分批工藝（工藝A，1000L規(guī)模）、N-1強(qiáng)化補(bǔ)料分批工藝（工藝B，1000L規(guī)模）以及N-1灌流強(qiáng)化補(bǔ)料分批工藝（工藝C，2000L規(guī)模）。其中，工藝C在上游階段采用了N-1灌流技術(shù)，并在下游引入多柱層析（MCC）和集成精純步驟，顯著提升了生產(chǎn)效率。該工藝展現(xiàn)出良好的可擴(kuò)展性，并通過(guò)工藝優(yōu)化有效降低了生產(chǎn)成本，為未來(lái)實(shí)現(xiàn)全面連續(xù)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖1

注：工藝A采用傳統(tǒng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)，工藝B在N-1階段采用批量培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式來(lái)提升的N階段細(xì)胞接種密度，工藝C在N-1種子培養(yǎng)階段引入灌流操作來(lái)提升的N階段細(xì)胞接種密度

作者比較了N-1階段種子培養(yǎng)在不同工藝下的活細(xì)胞密度（VCD）、細(xì)胞活力以及后續(xù)補(bǔ)料分批生產(chǎn)的性能。結(jié)果顯示，在200L至500L規(guī)模中，傳統(tǒng)補(bǔ)料分批工藝A的VCD為4.29±0.23×10?cells/mL，而通過(guò)強(qiáng)化的工藝B和工藝C，VCD顯著提高，分別達(dá)到了14.3±1.5×10?cells/mL和103±4.6×10?cells/mL，尤其是工藝C，顯示出灌流技術(shù)對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增的顯著積極作用（圖a）。盡管工藝A和B的細(xì)胞活力差異不大，工藝C的細(xì)胞活力略有下降，但未對(duì)后續(xù)的生產(chǎn)培養(yǎng)造成顯著影響（圖b）。在1000L至2000L規(guī)模中，工藝C的VCD達(dá)到了29.3±2.19×10?cells/mL，遠(yuǎn)高于工藝A和B（圖c和d），表明工藝C在大規(guī)模培養(yǎng)中同樣表現(xiàn)優(yōu)異。此外，工藝C的標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)量和細(xì)胞特異性產(chǎn)量也顯著高于工藝A和B（圖e和f），較工藝A和B分別增加了8倍和2倍，說(shuō)明通過(guò)引入N-1強(qiáng)化工藝，生產(chǎn)效率得到了大幅提升。

圖2

最近在Biotechnology Progress上發(fā)表了題為“Establishment of a high-throughput scale-down clone screening platform for intensified fed-batch culture of CHO cells”的研究論文中也提到過(guò)IFB平臺(tái)相比于TFB平臺(tái)的產(chǎn)量有著顯著的提升。在實(shí)驗(yàn)中，使用了三種單克隆抗體（mAb A、B和C），結(jié)果表明，與傳統(tǒng)補(bǔ)料批次（TFB）工藝相比，IFB工藝能夠顯著提高產(chǎn)量，可增加至9.6g/L。

圖3

在生物制藥領(lǐng)域，提升生產(chǎn)力一直是研發(fā)的核心目標(biāo)，工藝一直在迭代升級(jí)中。IFB通過(guò)N-1種子階段灌流培養(yǎng)，來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的接種密度，進(jìn)而獲得更高的產(chǎn)量。然而，這種強(qiáng)化策略也存在諸多挑戰(zhàn)。其中，由于次級(jí)代謝產(chǎn)物的快速積累和關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，細(xì)胞培養(yǎng)后期時(shí)常面臨著細(xì)胞活率快速下降、產(chǎn)品合成能力降低的問(wèn)題。近期，藥明生物自主開(kāi)發(fā)出間歇性灌流分批補(bǔ)料細(xì)胞培養(yǎng)（Intermittent-Perfusion Fed-Batch, IPFB）工藝，這種工藝是在IFB的生產(chǎn)過(guò)程中穿插一次或多次的間歇性灌流操作，將次級(jí)代謝物富集的細(xì)胞培養(yǎng)液及時(shí)排除，同時(shí)輸入新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而更好地維持細(xì)胞狀態(tài)來(lái)顯著提高產(chǎn)量。與此同時(shí)，通過(guò)使用較小孔徑（50 kD）的ATF細(xì)胞灌流系統(tǒng)，將產(chǎn)物截留在反應(yīng)器內(nèi)，完成生產(chǎn)末期一次性產(chǎn)品收獲操作。相較于IFB，IPFB模式可以將產(chǎn)量平均提升50%。

圖4

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一路“升級(jí)打怪”，但始終難以滿足市場(chǎng)“玩家”在增加產(chǎn)量和降低成本方面不斷增長(zhǎng)的需求。艾貝泰立足于生物工藝的優(yōu)化、放大和生產(chǎn)，不斷完善生物制藥領(lǐng)域的產(chǎn)品線（ 反應(yīng)器系列有：AbioBundle系列玻璃罐生物反應(yīng)器、AbioWave搖擺式一次性生物反應(yīng)器、AbioSUS一次性生物反應(yīng)器、AbioPilot不銹鋼生物反應(yīng)器），助力客戶不斷取得新的突破。

下圖為常見(jiàn)培養(yǎng)模式的優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)：