甲基綠染色液-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9767

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：甲基綠染色液

英文名稱：Methyl Green Staining Solution

產(chǎn)品規(guī)格：100ml

貨號：FS-X9767

產(chǎn)品介紹:

本染色液是一種組織或細(xì)胞染色時常用的可以把細(xì)胞核染成綠色的染色液。甲基綠可以和細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生細(xì)胞核染色。本染色液可以和免疫熒光染色或免疫組化染色配合使用。一方面可以在本甲基綠染色液染色后進(jìn)行免疫熒光染色或其它染料的染色，另一方面也可以在免疫組化染色后再進(jìn)行甲基綠復(fù)染。一個包裝的本染色液至少可以染色200個樣品。

注意事項：

1. 需自備4%多聚、70%乙醇和95%乙醇。如果需要脫水、透明和封片處理，還需自備二甲苯，中性樹膠或其它封片劑。如果樣品是石蠟切片，需自備90%乙醇，無水乙醇以及二甲苯。

2. 第一次使用本試劑盒時建議先取1-2個樣品做預(yù)實驗。

儲存條件：室溫，有效期一年。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

天冬酰胺內(nèi)肽(LGMN)英文名：LGMN 軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白1抗體包裝5g

天冬酰胺合成(ASNS)英文名：ASNS β-酪蛋白抗體包裝100g

天冬轉(zhuǎn)2(AST2)英文名：AST2 21號染色體開放閱讀框63抗體包裝25g

天冬轉(zhuǎn)(AST)英文名：AST 4號染色體開放閱讀框52抗體包裝1g

套膜蛋白(iNV)英文名：iNV 4號染色體開放閱讀框40抗體包裝5g

糖原磷化M(PYGM)英文名：PYGM Cullin3抗體包裝1g

糖原磷化L(PYGL)英文名：PYGL 分裂周期同源蛋白40抗體包裝5g

糖原磷化B(PYGB)英文名：PYGB 卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白106抗體包裝100g

糖原合激3α(GSK3α)英文名：GSK3α 染色質(zhì)修飾蛋白1A抗體包裝25g

糖皮質(zhì)激受體β(GRβ)英文名：GRβ 葉綠體伴侶蛋白抗體（蘋果）包裝100g

糖皮質(zhì)激受體α(GRα)英文名：GRα 分裂周期蛋白20B抗體包裝25g

糖抗原125(CA125)英文名：CA125 周期調(diào)控蛋白D1抗體包裝100ml

碳酐Ⅸ(CA9)英文名：CA9 周期蛋白B1結(jié)合蛋白1抗體包裝25ml

碳酐Ⅱ(CA2)英文名：CA2 周期調(diào)控因子14A抗體包裝500ml

碳酐Ⅰ(CA1)英文名：CA1 第七號染色體開放閱讀框12抗體包裝1g

膠紅酵母Rhodotorula│mucilaginosa 質(zhì)量規(guī)格：效價測定組蛋白H2b試劑盒澤瀉A-24-醋酯;Alisol A

白鱗蘑菇Agaricus│bernardii Quél. 質(zhì)量規(guī)格：>750ug /mg,USP,培養(yǎng)級組試劑盒棕櫚酯;Methyl hexadec

深海海旋菌Thalassospira│profundimaris 質(zhì)量規(guī)格：含量測定足標(biāo)記蛋白/足盂蛋白試劑盒左旋千金藤啶堿;L-Stepholidi
甲基綠染色液腫囊腐霉 4-氟-2-色P4501A2

立枯絲核 4,5-二氨基-1-(2-)吡唑硫鹽色P4502E1

大腸埃希氟化鋅四水合物色P450c21A;21-羥化

無色殼囊孢基阿維鹽外基質(zhì)金屬蛋白誘導(dǎo)因子

角磷灰鵝膏 4-乙?；』阴ネ饣|(zhì)磷糖蛋白

匍匐曲霉乙酰酮釔水合物外信號調(diào)節(jié)激

隆紋黑蛋巢 5-氧代-己甲酯外信號調(diào)節(jié)激

枯草芽孢桿四苯基四苯基磷纖維連接蛋白

長枝木霉 3-溴異煙因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1

腹膜蒼黃球 3-溴-4-基吡啶因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3

球孢白僵結(jié)晶紫內(nèi)酯周期D1

多殺性巴氏桿* 3,5-二異煙周期E1

鮑氏不動桿比馬前列周期抑制蛋白p27;Kip1

釀酒酵母 2-溴-5-基吡啶細(xì)絲蛋白A

類干酪乳桿丁環(huán)己酯下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)