核轉(zhuǎn)位分析試劑盒(單分子轉(zhuǎn)位)(FM法)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9786

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：核轉(zhuǎn)位分析試劑盒(單分子轉(zhuǎn)位)(FM法)

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：100T

貨號(hào)：FS-X9786

產(chǎn)品介紹:

NF-κB是一個(gè)多向性核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子、生長因子、免疫受體、氧化應(yīng)激相關(guān)酶、轉(zhuǎn)錄因子、急性時(shí)相蛋白等基因的表達(dá),功能涉及相應(yīng)的許多生理、病理過程。

DAPI 是一種藍(lán)色核酸染料，優(yōu)先染dsDNA，DAPI 表現(xiàn)為可集中結(jié)合在DNA 雙鏈的AT 小溝，結(jié)合后的DAPI 熒光會(huì)發(fā)生20倍增強(qiáng)。同時(shí)，DAPI 也可以結(jié)合RNA，與DNA 不同，一般認(rèn)為DAPI 結(jié)合于RNA 的AU 區(qū)。DAPI/RNA 的復(fù)合體（500nm）有比DAPI/dsDNA 復(fù)合體（460nm）更長的熒光波長。DAPI 是一種常用的多色熒光技術(shù)中的核復(fù)染劑。

NF-κβ作為一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，被激活由胞漿轉(zhuǎn)入胞核，從而參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等。可以將細(xì)胞核和NF-κβ分別用DAPI 和FITC 染色，F(xiàn)lowSight 可觀察每個(gè)細(xì)胞是否發(fā)生NF-κβ核轉(zhuǎn)位，并量化分析NFkB 核轉(zhuǎn)位程度以及發(fā)生核轉(zhuǎn)位細(xì)胞的比例。

儲(chǔ)存：4℃避光，有效期12個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

聚集蛋白聚糖(AGC)英文名：AGC 磷化原癌基因c-Jun抗體包裝5g

巨噬細(xì)胞炎性蛋白相關(guān)蛋白1(MRP1)英文名：MRP1 磷化原癌基因c-Jun抗體包裝25g

巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β(MIP3β)英文名：MIP3β 1號(hào)染色體開放閱讀框86抗體包裝5g

巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(MIP3α)英文名：MIP3α 8號(hào)染色體開放閱讀框59抗體包裝10MG

巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP1β)英文名：MIP1β 磷化補(bǔ)體成分5受體1抗體包裝1g

巨噬細(xì)胞來源趨化因子(MDC)英文名：MDC 補(bǔ)體C6抗體包裝1g

巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)英文名：MCSF 癌胚抗原相關(guān)粘附分子7抗體包裝1g

靜止Q6硫基氧化1(QSOX1)英文名：QSOX1 磷化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CEBP β抗體包裝1g

精胺氧化(SMOX)英文名：SMOX 磷化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CEBP β抗體包裝1g

精(Arg)英文名：Arg 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子C/EBPδ抗體包裝1g

精加壓原(VP)英文名：VP 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子C/EBPε抗體包裝5g

精加壓受體1B(AVPR1B)英文名：AVPR1B 磷化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子C/EBPε抗體包裝1ml

精/絲豐富剪接因子4(SRSF4)英文名：SRSF4 腦血管內(nèi)皮粘附分子1抗體包裝5ml

晶狀體蛋白αB(CRYαB)英文名：CRYαB 補(bǔ)體C1QL4鏈多肽抗體包裝1g

金屬硫蛋白1(MT1)英文名：MT1 19號(hào)染色體開放閱讀框2抗體包裝5g

蠟狀芽孢桿菌Bacillus│cereus 質(zhì)量規(guī)格：含量≥700IU/mg,BR脂聯(lián)受體1試劑盒獐牙菜苦;Swertiamarine

巴氏醋桿菌Acetobacter│pasteurianus 質(zhì)量規(guī)格：效價(jià)測定脂聯(lián)試劑盒芝麻;Sesamin

ATCC56023資源名稱: 戴爾根霉質(zhì)量規(guī)格：>99%,USP,BR脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5試劑盒2-乙酰基洋;2-Acetyla
核轉(zhuǎn)位分析試劑盒(單分子轉(zhuǎn)位)(FM法)玫瑰綠色鏈霉 2--3-氟芐脂肪結(jié)合蛋白

魔鬼弧 2,4-二苯甲脂肪型脂肪結(jié)合蛋白

溥硬皮馬勃 2-溴-3-吡啶脂肪型脂肪結(jié)合蛋白

鉤狀木霉 2,3,4-三氟溴苯脂褐

大豆慢生根瘤 2-氨基-7-氧代-4,5,6,7-四氫-1-苯并噻吩-3-羧乙酯脂褐質(zhì)

多殺性巴氏桿 D-(+)-乳甲酯脂類唾液

粗柄羊肚 Fura-2 ethyl ester脂聯(lián)受體1

大腸埃希對環(huán)己酮甲乙酯脂聯(lián)受體2

變灰鏈霉 2-甲基丁脂磷壁

秀珍菇 1,6-萘二磺二鈉鹽脂酰-CoA合成

大腸埃希氏 N-芐基馬來酰亞脂氧A4

盔形畢赤酵母苯甘鄧鹽直接膽紅

金橫裂鏈霉 N-基乙亞乙酯中間α球蛋白抑制因子H1

乳明串珠 2，3-二溴中間α球蛋白抑制因子H4

熱帶假絲酵母 2,4,6-三叔丁基苯中介
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)