Hoechst33342染色液(1mg/ml)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號	FS-X9882

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：Hoechst33342染色液(1mg/ml)

英文名稱：Hoechst33342 Staining Solution(1mg/ml)

產(chǎn)品規(guī)格：1ml|5×1ml

貨號：FS-X9882

產(chǎn)品介紹:

用途：

細(xì)胞周期分析、活細(xì)胞染色等

注意事項(xiàng)：

Hoechst33342是一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。染色染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測?？芍苯佑糜诠潭?xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。

儲存條件：-20℃，避光，12個(gè)月

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

山扁豆生棒孢α2C-AR腎上腺能受體抗體Human CAMK2B(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II subunit beta) 豬D二聚體(D2D)免疫試劑盒

瑞氏青霉中心體蛋白AZI1抗體Human CDCA8(Cell division cycle-associated protein 8) 豬C肽(C-Peptide)免疫試劑盒

大麗花輪枝孢α蛋白激3抗體（心?。〩uman MAP4K4 豬C反應(yīng)蛋白(CRP)免疫試劑盒

葡枝根霉表皮型脂氧合3抗體（魚鱗病相關(guān)蛋白）Human MAP4K5 豬c-fos 免疫試劑盒

研究團(tuán)隊(duì)節(jié)桿菌錨蛋白重復(fù)域28抗體Human Matrilin 2 豬B淋巴瘤因子2(Bcl-2)免疫試劑盒

芽孢八疊球菌屬淋巴相關(guān)AF4樣蛋白抗體Human MAPK11(Mitogen-activated protein kinase 11) 豬Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)免疫試劑盒

乳酒假絲酵母錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白12抗體Human MAP7 豬Apelin(APLN)免疫試劑盒

玫煙色棒束孢錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白13A抗體Human MAP7 豬5羥色(5-HT)免疫試劑盒

秀珍菇錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白9抗體Human MAPK12 豬Ⅲ型前膠原肽(PⅢNP)免疫試劑盒

冷溫木拉克酵母錨蛋白重復(fù)及SAM結(jié)構(gòu)域蛋白1A抗體Human MAPK4 豬Ⅲ型前膠原基末端肽(PⅢNP)免疫試劑盒

樹脂殼菌脂肪特定轉(zhuǎn)錄因子2抗體Human MAPK13 豬Ⅲ型前膠原基端肽(PⅢNT)免疫試劑盒

金黃紅色球菌載脂蛋白L3抗體Human MAPK7 豬Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)免疫試劑盒

釀酒酵母腫瘤/抗原81抗體Human MAPK6 豬25羥基維生D3(25 HVD3)免疫試劑盒

芽胞桿菌共濟(jì)失調(diào)蛋白7樣2抗體Human MAPKBP1 豬Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP)免疫試劑盒

釀酒酵母鹽耐藥蛋白ARS2抗體Human Marcks 豬17羥孕(17-OHP)免疫試劑盒

約氏乳桿菌芳香基硫酯1抗體Human MAPRE2 豬1,25二羥基維生D3(1,25 DHVD3)免疫試劑盒

大腸埃希氏菌Escherichia│coli 質(zhì)量規(guī)格：>99%,AR二試劑盒異橙黃

巴斯德畢赤酵母Pichia│pastoris 質(zhì)量規(guī)格：>98%，BR轉(zhuǎn)/谷轉(zhuǎn)試劑盒月桂氮卓

枯草芽孢桿菌Bacillus│subtilis 質(zhì)量規(guī)格：>99%,AR別孕烯/3α,5α-四氫孕試劑盒油
Hoechst33342染色液(1mg/ml)普通變形桿 3-基苯頻哪酯盤狀結(jié)構(gòu)域受體家族成員1

橙鱗傘2 正戊基三苯基溴化磷血管內(nèi)皮生長因子受體1

北里胞 5-溴-3--2-甲甲酯血管內(nèi)皮生長因子受體4

羊無漿體（青海海宴株） (三苯基亞正膦基)乙視黃

鮑姆針層孔 (S)-(-)-2-羧基環(huán)丁鱗狀癌相關(guān)抗原2

枯草芽孢桿 2--6-甲神經(jīng)營養(yǎng)受體P75

鼠李糖乳桿 3-溴苯基硫脲低氧誘導(dǎo)因子1

棘孢曲霉 4,6-二-5-氟嘧啶精漿彈性硬蛋白

釀酒酵母 1-芐基-2-羧精漿彈性硬蛋白

類阿達(dá)青霉 4-異硫苯酯糖類抗原15-3

帶小棒鏈霉 2-(3,4-二芐基)苯并咪唑半乳糖

都柏林克羅諾桿都柏林亞種 2,3-二溴-1,4-二半胱氨酰白三烯

球孢白僵 3-溴-5-氟苯乙DDX4

Sphingomonas abaci 1-萘乙乙酯基膜聚糖；內(nèi)腔蛋白

大腸埃希 3-羥基己甲酯前腎
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)