BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9795

中文名稱：BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒

英文名稱：BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit

產(chǎn)品規(guī)格：共100ml

貨號：FS-X9795

產(chǎn)品介紹:

BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒是一種用于免疫組化顯色、Western 等膜顯色和誘導多功能干細胞iPS 鑒定等的試劑盒。

BCIP/NBT 是堿性磷酸酯酶的常用底物。在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP 會被水解產(chǎn)生強反應性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會和NBT 發(fā)生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色的NBT-formazan。

本試劑盒可以用于細胞或組織的堿性磷酸酯酶顯色包括誘導多功能干細胞iPS 的鑒定，也可以用于Western 等結合有堿性磷酸酯酶的膜的顯色檢測。同時也可以用于細胞或組織內(nèi)源性的堿性磷酸酯酶顯色。

組份規(guī)格：

試劑A：堿性磷酸酯酶顯色緩沖液 100ml

試劑B：BCIP 溶液(300X) 350μl

試劑C：NBT 溶液(150X) 700μl

使用說明

1. 對于組織切片或細胞樣品或膜，在與堿性磷酸酯酶標記的抗體或其它形式的探針孵育后，用適當洗滌液洗滌3-5 次，每次3-5 分鐘。對于檢測內(nèi)源性堿性磷酸酯酶的組織或細胞樣品，在適當固定后，也用適當洗滌液洗滌3-5 次，每次3-5 分鐘。

2. 按照如下比例依次加入各溶液，混勻后即配制成BCIP/NBT 染色工作液，配方如下：試劑A：堿性磷酸酯酶顯色緩沖液 3mL試劑B：BCIP 溶液(300X) 10μL試劑C：NBT 溶液(150X) 20μL染色工作液總體積：3.03mL

3. 后一次洗滌完畢后，去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT 染色工作液，確保能充分覆蓋樣品。

4. 室溫避光孵育5-30 分鐘或更長時間(可長達24 小時)，直至顯色至預期深淺。

5. 去除BCIP/NBT 染色工作液，用蒸餾水洗滌1-2 次即可終止顯色反應。

6. 對于組織切片或細胞樣品，顯色反應終止后，如有必要可以用中性紅染色液(neutral red staining solution)染色，以便于觀察。對于膜，顯色反應終止后，可以室溫晾干避光保存。

儲存：4℃，有效期一年。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

胱天蛋白11(P11)英文名：P11 C型凝集結構域家族4成員C抗體包裝25mg

胱天蛋白1(P1)英文名：P1 CD226抗體包裝25g

胱硫醚β合(CβS)英文名：CβS CD26抗體包裝5g

骨形成蛋白8B(BMP8B)英文名：BMP8B 免疫球蛋白G Fc段受體Ⅱ/Fc γ RII a抗體包裝5g

骨形成蛋白6(BMP6)英文名：BMP6 緊密連接蛋白20抗體包裝1g

骨形成蛋白1(BMP1)英文名：BMP1 中心體蛋白135抗體包裝5g

骨骼肌特異性受體酪激(MUSK)英文名：MUSK 半胱蛋白蛋白-7抗體包裝100g

骨骼肌慢肌肌鈣蛋白T(TNNT1)英文名：TNNT1 鈣調(diào)節(jié)抗體（鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)）包裝10g

骨骼肌快肌肌鈣蛋白I(TNNI2)英文名：TNNI2 1號染色體開放閱讀框181抗體包裝25g

骨鈣(OC)英文名：OC Ⅰ型補體受體抗體（C3b/C4b受體抗體）包裝25mg

骨成型蛋白受體Ⅱ(BMPRⅡ)英文名：BMPRⅡ 8型膠原/內(nèi)皮膠原蛋白抗體包裝1g

骨成型蛋白受體1A(BMPR1A)英文名：BMPR1A 結合轉(zhuǎn)化激活因子CITED1抗體包裝5g

骨成型蛋白7(BMP7)英文名：BMP7 色P450 2C9抗體包裝10MG

骨成型蛋白4(BMP4)英文名：BMP4 色P450 2D6抗體包裝100g

骨成型蛋白2(BMP2)英文名：BMP2 血小板活化因子CTR9抗體包裝25g

特羅伊察棲砂桿菌Arenibacter│troitsensis 質(zhì)量規(guī)格：效價測定早老2試劑盒乙?；邹继J;Acetyl-trans

長柄鏈格孢Alternaria│longipes 質(zhì)量規(guī)格：>98%,合物早老1試劑盒羊藿次II;Icarisid II

鮑希瓦氏菌Shewanella│haliotis 質(zhì)量規(guī)格：>99%,USP32,BR,可用于培養(yǎng)再生胰島衍生1α/胰石蛋白/胰線蛋白試劑盒茵芋;Skimmin
BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒細孢毛霉亞磷二異丁酯4-羥基苯酮雙加氧

匍枝根霉(黑根霉) 6-氨基-吡-2-羧甲酯COP9結構光形態(tài)發(fā)生同源物亞基2

Aureimonas frigidaquae N-(3-氨基基)-N-甲基叔丁酯鹽鹽COP9結構光形態(tài)發(fā)生同源物亞基2抗體

光帽鱗傘(滑菇) S-甲基-L-半胱CC趨化因子配體1

茶藨子葡萄座腔 4-溴-3,5-二三氟甲苯RIG-I

釀酒酵母 N,N-雙(2-乙基)叔丁酯柯薩奇病B3

橄欖綠鏈霉 4-(二氟甲氧基)-3-(環(huán)氧基)苯甲DNA甲基轉(zhuǎn)移3A2

白僵 1,1,2,3,3-五烷雌受體γ

冬菇屬膽固琥珀單酯柯薩奇病

米曲霉 3-(4-溴芐基)-2-丁基-5--4-咪唑甲G_(i;o)蛋白

耐冷冷桿 Nα,Nε-雙(叔丁氧羰基)-L-賴二環(huán)己鹽蛋白聚糖A

普通鏈霉甲氧基去氧腎上腺鹽鹽蛋白聚糖B

香菇反式-4'-乙基-[1,1'-聯(lián)環(huán)己烷]-4-酮酪氨基轉(zhuǎn)移

Paucimonas lemoignei 5-(2-甲氧基苯氧基)-[2,2-二嘧啶]-4,6(1H,5H)-二酮谷氨基轉(zhuǎn)移

芽孢桿屬 2-(2-甲氧基苯氧基)二二甲酯補體蛋白1

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