Hoechst 33342/PI雙染試劑盒-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號	FS-X9827

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：Hoechst 33342/PI雙染試劑盒

英文名稱：Apoptotic Cell Hoechst 33342/PI Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：100T

貨號：FS-X9827

產(chǎn)品介紹:

熒光染料Hoechst33342 能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上低藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst33342 比正常細(xì)胞的多，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，此外，凋亡細(xì)胞的染色體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA 結(jié)合，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst33342 排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。而PI 染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中，即活細(xì)胞對PI 染料拒染，而壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI 染料染色。

用Hoechst33342 結(jié)合PI 染料對凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色，就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色（Hoechst33342+/PI+），凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色（Hoechst33342+/PI++）

儲(chǔ)存：2-8℃，避光，有效期一年。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

Ⅱ型前膠原基端原肽(PⅡNT)英文名：PⅡNT 磷化熱休克蛋白β5/α晶狀體球蛋白B/αB-crystallin抗體包裝50mg

Ⅱ型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTXⅡ)英文名：CTXⅡ 1號染色體開放閱讀框167抗體包裝1g

Ⅱ型膠原(COL2)英文名：COL2 1號染色體開放閱讀框168抗體包裝250mg

ⅡD組磷脂A2(PLA2G2D)英文名：PLA2G2D 1號染色體開放閱讀框170抗體包裝250mg

ⅡA組磷脂A2(PLA2G2A)英文名：PLA2G2A 1號染色體開放閱讀框172抗體包裝1g

Ⅰ型前膠原羧基端原肽(PⅠCP)英文名：PⅠCP 1號染色體開放閱讀框173抗體包裝5g

Ⅰ型前膠原基端原肽(PⅠNP)英文名：PⅠNP 1號染色體開放閱讀框174抗體包裝25g

Ⅰ型前膠原(PCⅠ)英文名：PCⅠ 1號染色體開放閱讀框177抗體包裝5g

Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTXⅠ)英文名：CTXⅠ 1號染色體開放閱讀框180抗體包裝1g

Ⅰ型膠原交聯(lián)基端肽(NTXⅠ)英文名：NTXⅠ 1號染色體開放閱讀框182抗體包裝1g

Ⅰ型膠原α2(COL1α2)英文名：COL1α2 1號染色體開放閱讀框183抗體包裝25g

Ⅰ型膠原α1(COL1α1)英文名：COL1α1 1號染色體開放閱讀框187抗體包裝5g

Ⅰ型膠原(COL1)英文名：COL1 1號染色體開放閱讀框189抗體包裝5g

90kDa熱休克蛋白β1(HSP90β1)英文名：HSP90β1 1號染色體開放閱讀框190抗體包裝100ml

90kDa熱休克蛋白αA1(HSP90αA1)英文名：HSP90αA1 1號染色體開放閱讀框192抗體包裝25ml

輪枝菌Verticillium│sp. 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標(biāo)準(zhǔn)品乙肝表面抗原大蛋白試劑盒原花青B2;Procyanidin B

球孢白僵菌Beauveria│bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR乙脫氫試劑盒原花青B1;Procyanidin B

鏈霉菌屬菌種Streptomyces│sp. 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標(biāo)準(zhǔn)品乙呋試劑盒乙酰紫堇靈;Acetylcorynoli
Hoechst 33342/PI雙染試劑盒 叔丁基二硫抗mannobioside糖抗體

亮白曲霉 2,2-二氟-3-羥基戊乙酯鋅-α2脂蛋白

烏克蘭毛霉 2-溴-3,4-二氟苯巖藻糖基化觸珠蛋白

短柄帚霉 6-甲基-3H-噻吩[2,3-d]嘧啶-4-酮膽固-25-羥化

鼠李糖乳桿磺酚S受體自身抗體

產(chǎn)氣腸桿* 3,5-二溴-2-吡受體

新疆鹽單胞 5-溴-4-甲基-1H-吲唑S轉(zhuǎn)移Mu1

禾谷鐮孢 2--3-氟-5-硝基吡啶乙酰CoA羧化

總狀共頭霉噻吩并[3,2-b]吡啶-7-蛋白激M2

大孢聯(lián)軛霉 5-溴吲唑-3-甲系統(tǒng)性紅斑狼瘡IgG

黑曲霉 2-乙硫基-5-硝基吡啶系統(tǒng)性紅斑狼瘡IgA

圍小叢殼 L-肌肽鋅系統(tǒng)性紅斑狼瘡IgM

蠟樣芽胞桿 4-苯氧基芐糖化血紅蛋白

博斯氏屬 2-叔丁苯纖維蛋白單體

葉球形微桿 4,6-二-2-甲氧基嘧啶酮激M2
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)