【儀表網(wǎng) 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)】近日，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃《大規(guī)模并行測(cè)序 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估》編制完成并征求意見(jiàn)，時(shí)間截止到2023年6月23日。主要起草單位為中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院等。
 

　　測(cè)序技術(shù)應(yīng)用廣泛，一次測(cè)序得到大量數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)整理與分析是高通量測(cè)序應(yīng)用于生物研究最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，若未按需求對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與評(píng)估，則所測(cè)得數(shù)據(jù)無(wú)法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有效的數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量控制有利于物種鑒定、病原體識(shí)別、病毒基因溯源、醫(yī)療診斷、環(huán)境微生物檢測(cè)、測(cè)序儀校準(zhǔn)等需要，用于通過(guò)測(cè)序和序列比對(duì)分析來(lái)進(jìn)行基因鑒定的行業(yè)/科研領(lǐng)域。
 

　　大規(guī)模并行測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估是一項(xiàng)跨領(lǐng)域的分析手段，涉及生物信息學(xué)知識(shí)較多，廣泛影響生物科技的許多方面。例如，在食品領(lǐng)域，即使沒(méi)有參考樣本或參考基因序列，通過(guò)對(duì)植物或動(dòng)物產(chǎn)品中源性成分各目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息比對(duì)即可確定源性，以進(jìn)行物種真實(shí)性鑒定，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜背景樣本和未知物種樣本中各種源性成分信息的高通量檢測(cè)，用于品牌維護(hù)及肉類(lèi)摻假鑒定;對(duì)土壤、水體、空氣中微生物及發(fā)酵產(chǎn)品、果蔬貯藏過(guò)程中微生物的多樣性及功能分析;通過(guò)血清中腫瘤標(biāo)志物的測(cè)定，協(xié)助腫瘤的診斷、預(yù)后判斷及療效評(píng)價(jià);通過(guò)檢測(cè)腫瘤患者特定的基因變異情況，協(xié)助實(shí)施針對(duì)靶點(diǎn)的精準(zhǔn)治療方案;基于reads 深度、雙末端映射、拆分read、從頭拼接等方法檢測(cè)拷貝數(shù)變異，以探究人類(lèi)多種疾病的成因。
 

　　大規(guī)模并行測(cè)序技術(shù)由于其準(zhǔn)確性和檢測(cè)通量改變了整個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展。一次高通量測(cè)序可以讀取400 000-4 000 000條序列，不同的測(cè)序平臺(tái)可讀取到的堿基數(shù)不等，測(cè)序平臺(tái)的不斷進(jìn)步與更新促進(jìn)了測(cè)序方法/儀器的廣泛發(fā)展，目前NGS 的主要代表平臺(tái)有Illumina公司的Solexa基因組分析儀、華大基因的MGISEQ-2000平臺(tái)及ABI的SOLiD測(cè)序儀，Solexa 聚合酶合成測(cè)序的關(guān)鍵技術(shù)是:“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)”，SOLiD連接酶測(cè)序取代了傳統(tǒng)PCR，可對(duì)單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量測(cè)序。
 

　　然而，對(duì)測(cè)序所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。首先，一次測(cè)序得到海量數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)分析處理需采用大量軟件及工具，要求試驗(yàn)人員熟練操作各項(xiàng)軟件并具有生物信息學(xué)知識(shí)的儲(chǔ)備;其次，測(cè)序過(guò)程中存在儀器報(bào)錯(cuò)的可能性，影響測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量，加大數(shù)據(jù)分析難度;此外，核酸濃度及純度未達(dá)到測(cè)序要求、選擇不合適的文庫(kù)制備方法會(huì)影響測(cè)序結(jié)果，導(dǎo)致檢測(cè)效率低、準(zhǔn)確性差。
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)的研制有利于提高測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可信度、支持測(cè)序方法的選擇和優(yōu)化、提供可用于性能資質(zhì)鑒定的關(guān)鍵性能參數(shù)。具有更高可信度的生物技術(shù)和生物學(xué)工業(yè)數(shù)據(jù)，能實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享，提升檢測(cè)準(zhǔn)確性，減少風(fēng)險(xiǎn)和成本，促進(jìn)國(guó)際交流。
 

　　本文件適用于測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估與驗(yàn)證。確定了原始數(shù)據(jù)的評(píng)估指標(biāo)(序列長(zhǎng)度分布、每個(gè)序列GC含量、質(zhì)量值、序列重復(fù)水平、超出閾值水平、集群密度、出錯(cuò)率等)、分析用于不同應(yīng)用的序列校正及比對(duì)軟件;測(cè)序校正和比對(duì)的質(zhì)量控制，包括單端測(cè)序片段比對(duì)，配對(duì)段測(cè)序片段比對(duì)，子片段的長(zhǎng)度比對(duì);變異識(shí)別，能識(shí)別SNV、插入缺失、CNV和SVs 四種變異類(lèi)型，變異識(shí)別質(zhì)量指標(biāo)包括變異質(zhì)量值、等位基因讀取百分比、樣品間污染分析等;質(zhì)量指標(biāo)驗(yàn)證，包括建立去除低質(zhì)量堿基的方法、確定比對(duì)質(zhì)量參數(shù)、定義平均覆蓋范圍;高通量測(cè)序方法特異性及靈敏度確認(rèn)(單一物種驗(yàn)證、混合樣品檢測(cè)、不同加工方式樣品檢測(cè))。