Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9700

產(chǎn)品介紹:

產(chǎn)品背景：

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過(guò)程等方面起著十分重要的作用。

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨suan(PS)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨suan(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。在體內(nèi)，巨噬細(xì)胞可以識(shí)別翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面的PS 從而將這些程序性死亡的細(xì)胞清除，因此凋亡過(guò)程中并不伴隨局部的炎癥反應(yīng)，而在細(xì)胞壞死的過(guò)程中則常常伴隨著炎癥反應(yīng)。

AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS 高親和力特異性結(jié)合。PS 外翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得Annexin V 與PS的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測(cè)標(biāo)志事件。

檢測(cè)原理：

在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨suan(phosphotidylserine，PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。

Annexin-Ⅴ能與PS 高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨suan與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。用標(biāo)記了APC的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞壞死的過(guò)程中也會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜損傷，壞死的細(xì)胞會(huì)結(jié)合Annexin V-APC。

Annexin V-APC 通常與細(xì)胞膜非滲透性核酸熒光染料聯(lián)合使用以檢測(cè)凋亡細(xì)胞。常用的染料是7-AAD。正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的，核酸染料7-AAD 不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，7-AAD 能夠透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。

7-AAD/Annexin V-APC試劑盒將Annexin Ⅴ與7-AAD匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。壞死細(xì)胞可以同時(shí)與Annexin V-APC和7-AAD 結(jié)合顯色，而7-AAD 則被排除在活細(xì)胞(APC陰性)和早期凋亡細(xì)胞(APC陽(yáng)性)之外。在沒(méi)有巨噬細(xì)胞的情況下，凋亡的后階段會(huì)像細(xì)胞壞死一樣發(fā)生整個(gè)細(xì)胞的解體，從而使凋亡晚期的細(xì)胞也同時(shí)被APC和7-AAD 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性。

儲(chǔ)存條件：染色液2-8℃避光保存；結(jié)合液2-8℃保存；長(zhǎng)期不用-20℃保存。

Annexin V-APC染色液避免反復(fù)凍融，凍融2次以上可能會(huì)失效。長(zhǎng)期保存分裝后-20℃保存。

有效期：一年。

中文名稱：Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：50T|100T

貨號(hào)：FS-X9700

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

磷肌3激(PI3K)英文名：PI3K 自噬相關(guān)蛋白4D抗體包裝25g

磷化腺苷活化蛋白激(pAMPK)英文名：pAMPK 自噬相關(guān)蛋白9A抗體包裝5g

磷化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激(p-ERK)英文名：p-ERK 縮C抗體包裝500mg

磷化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激(pERK)英文名：pERK 谷草轉(zhuǎn)抗體包裝100g

磷化酪蛋白激JAK3(pJAK3)英文名：pJAK3 三磷腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員5抗體包裝25g

磷化核因子-κB(p-NF-κB)英文名：p-NF-κB 三磷腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員8抗體包裝500g

磷化蛋白激C(P-PKC)英文名：P-PKC ?；摎溟L(zhǎng)鏈抗體包裝25g

磷化蛋白激B(P-PKB)英文名：P-PKB ?；摎渲墟溈贵w包裝5g

磷化表皮生長(zhǎng)因子受體(pEGFR)英文名：pEGFR ?；摎涠替溈贵w包裝1g

磷化基末端蛋白激(P-JNK)英文名：P-JNK 過(guò)氧化物?；趸?抗體包裝25g

淋巴細(xì)胞趨化因子(Lptn/LTN/XCL1)英文名：Lptn/LTN/XCL1 磷化凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激1抗體包裝5g

淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原3(LFA-3/CD58)英文名：LFA-3/CD58 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)蛋白3抗體（半胱和絲富含核蛋白1）包裝1g

亮腦啡肽(Leu-ENK)英文名：Leu-ENK 有絲分裂激A/B/C抗體包裝5g

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)英文名：GM-CSF 蛋白酪激ATK抗體包裝1g

粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)英文名：G-CSF 長(zhǎng)鏈脂肪連接1/2抗體包裝1g

ASCL2蛋白抗體免疫球蛋白G(IgG)Torezolid (TR-701; tedizolid) is a novel oxazolidinone for gram-positive infecti
Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒雞傷寒沙門氏 2,4,6-三喹唑啉雌受體

三葉草根瘤 3'-氨基-4'-氟苯乙酮紅生成

鏈霉 DL-氨酰-DL-酸促紅生成抗體

滑菇 RS-127445 鹽酸鹽促紅生成受體

枯草芽孢桿 1-異基-3-氨基吡咯烷促黃體

烯霉鏈霉 Dimethylammoniumdichlorotri(mu-chloro)bis[(R)-(+)-促甲狀腺受體抗體

麥芽糖假絲酵母 4-溴-3-三氟甲基吡唑促甲狀腺

枯草芽孢桿 1-溴-3-甲基-2-丁酮促甲狀腺釋放

玫煙色棒束孢 2'-OMe-Ac-C亞磷酰單體促卵泡

玉米大斑病 N-乙?；?5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-甲氧基胞苷促腎上腺皮質(zhì)釋放

栗疫 4-甲基-L-苯氨酸促腎上腺皮質(zhì)

果生鏈核盤 3-甲基-4-促腎上腺皮質(zhì)釋放因子

新月彎孢 4-巰基-4-甲基-2-戊酮促生長(zhǎng)釋放

腐皮殼 2-氟-6-促胃液

石榴干腐 4'-氨甲基-6-羧基熒光促酰化蛋白

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